陳曉瑩，何昶昊，張曉萌，王 磊，石中玉，葛東宇，董瑞娟，閆 玥，葉一帆，胡素敏*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京100029）

電離輻射（ionizing radiation, IR）廣泛存在于自然界中，是一切能夠引起物質(zhì)發(fā)生電離的輻射總稱[1]。機(jī)體中的細(xì)胞對輻射的敏感性與其更新速率密切相關(guān)，即不斷分裂、更新的細(xì)胞輻射敏感性越高，受到的損傷越重[2]125。 而作為精子發(fā)生、性激素合成的重要性腺器官，睪丸中的生精細(xì)胞增殖分化活躍，其對電離輻射也十分敏感[3]。 課題組前期基于“未病先防”的治未病理論，采用預(yù)防性給藥的方式，觀察小鼠受照射后7 d 內(nèi)[4]及第21 天[5]睪丸的動態(tài)損傷情況以及高、中劑量益氣解毒方的防護(hù)作用，結(jié)果表明預(yù)防性給藥能夠在照射后短期（7 d 內(nèi)）有效改善小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)及生精功能的損傷。 若照射后不予治療，后期（21 d 內(nèi)）睪丸的進(jìn)行性損傷則無法得到快速修復(fù)。 因此，為了進(jìn)一步探究益氣解毒方對電離輻射致雄性小鼠生殖系統(tǒng)損傷的防治作用，本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，采用預(yù)防加治療的給藥方式，增設(shè)了益氣解毒方低劑量組，觀察照射后35 d（小鼠的生精周期[2]239）小鼠睪丸損傷情況以及3 個不同濃度組益氣解毒方的全面防護(hù)效應(yīng)，即預(yù)防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性BALB/c 小鼠60 只，體質(zhì)量為（20±2） g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2016-0011。 小鼠均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗動物房，環(huán)境溫度為（23±2） ℃，濕度為40%～60%，交替光照12 h/12 h 模擬晝夜時間，小鼠自由攝食飲水。本實驗研究由北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實驗動物倫理委員會審核通過，倫理審查編號為BUCM-4-2020091104-3044。

1.2 試劑及儀器

37%～40%甲醛（226396）、冰醋酸（B0801001）、乙醇（BH100223），均購自北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；蘇木素染色液（ZLI-9610）、伊紅染色液（ZLI-9613）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Tissue-Tek TEC5 組織包埋機(jī)（日本櫻花檢驗儀器 株 式 會 社）；Leica RM2235 組 織 切 片 機(jī)、Leica DM4 B 自動化智能型正置研究級顯微鏡（德國Leica 公司）；Sysmex XS-800i 全自動血液分析儀（日本Sysmex 公司）。

1.3 藥品及制備

益氣解毒方由當(dāng)歸、生黃芪、淫羊藿、枸杞子、西洋參等中藥組成（該方正在申請專利），以上中藥飲片均購自北京同仁堂（藍(lán)色港灣店），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥教研室李偉老師鑒定后制成復(fù)方水煎液。 該復(fù)方藥液制備參考本課題組前期方法[6]，復(fù)方飲片經(jīng)過浸泡、二次煎煮、濃縮、醇沉過夜（置于4 ℃冰箱中）、抽濾、回收乙醇，制成益氣解毒方原液，濃度為1.657 g/mL，即為本實驗中益氣解毒方高劑量（2 倍人體等效劑量），將部分原液稀釋成中劑量0.829 g/mL（人體等效劑量）和低劑量0.415 g/mL（0.5 倍人體等效劑量）。

本實驗選取安多霖(1809023，北京中日友好醫(yī)院)作為陽性藥，取安多霖膠囊中的藥粉，溶解于相應(yīng)體積的去離子水中，制成0.027 g/mL 的安多霖藥液（人體等效劑量）。

1.4 小鼠睪丸急性輻射損傷模型制備

采用照射劑量為2 Gy，劑量率為1 Gy/min 的60Co γ 射線（由北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院鈷源室提供鈷源）對小鼠進(jìn)行一次性全身照射，復(fù)制睪丸急性輻射損傷模型[7]。

1.5 動物分組及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)將60 只小鼠分為空白組（normal control group, NC 組）、 模型組（irradiationgroup, IR 組）、安多霖組（irradiation+anduolin group, IRA 組）， 以及益氣解毒方高（irradia tion+YQJD high-dose group, IRYH 組）、中（irradiation+YQJD middle-dose group, IRYM 組）、低劑量組（irradiation+YQJD low-dose group, IRYL 組），每組10 只。照射前第7 天(-7 d)，各組小鼠預(yù)防性給水/藥干預(yù)：NC 組和IR 組每日以去離子水灌胃；IRA 組每日以安多霖藥液灌胃；IRYH 組、IRYM 組以及IRYL 組每日分別以相應(yīng)濃度水煎液灌胃，灌胃體積均為0.02 mL/g 體質(zhì)量，每日1 次，共7 d。 之后，除NC 組外，其余各組小鼠用“1.4”造模方法復(fù)制睪丸急性輻射損傷模型。于照射后第4 天開始治療性給水/藥干預(yù)，方式及劑量同前，持續(xù)至照射后第34 天，然后禁食不禁水12 h，于次日即照射后第35 天取材檢測。

1.6 指標(biāo)檢測與方法

1.6.1 體質(zhì)量測定 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，分別于照射前第7 天（-7 d）、照射當(dāng)天（0 d）、照射后第4、15、35 天（4、15、35 d），稱取并記錄小鼠的體質(zhì)量。1.6.2 全血細(xì)胞計數(shù) 照射后第35 天，采用眼球取血法取小鼠全血100 μL，用EDTA -K2 抗凝，于全自動血液分析儀檢測紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）、白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYMP）以及中性粒細(xì)胞（NEUT）。

1.6.3 睪丸、附睪質(zhì)量測定 小鼠摘眼球取血后，脫頸椎處死，取雙側(cè)睪丸、附睪，分別稱取質(zhì)量。

1.6.4 HE 染色 取單側(cè)睪丸及附睪置于改良Davidson's 固定液[8]中（37%～40%甲醛溶液∶無水乙醇∶冰醋酸∶去離子水=6∶3∶1∶10）。 24 h 后，將固定液換成10%的中性甲醛溶液。 酒精梯度脫水后用石蠟包埋，取蠟塊4 μm 連續(xù)切片，切片按照HE 染色常規(guī)方法進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇下行復(fù)水、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、自來水沖洗，伊紅復(fù)染后，梯度乙醇上行脫水及二甲苯透明。中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸、附睪的組織形態(tài)。

1.6.5 睪丸生精上皮厚度半定量分析 將制備好的睪丸HE 染色切片置于光學(xué)顯微鏡視野（×400）下，攝取照片。觀察其組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)，通過Image-ProPlus 軟件測量生精上皮的厚度（從基底膜到管腔），記錄并分析統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 照射前后各組小鼠體質(zhì)量變化

照射前各組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。小鼠受照射后，IR 組與NC 組比較，照射后第4、15 天體質(zhì)量均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。 照射后第4 天，與NC 組比較，IRA 組和IRYM 組、IRYL組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），IRYH 組體質(zhì)量顯著下降(P＜0.01)；與IR 組比較，IRA 組體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）；與IRA 組及IRYM 組比較，IRYH 組體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），其余各給藥組間體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）。 照射后第15天，各照射組體質(zhì)量均明顯低于NC 組（P＜0.01，P＜0.05），各照射組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。照射后第35 天，各組體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見表1。

2.2 照射后第35 天各組小鼠全血細(xì)胞計數(shù)變化

照射后第35 天，IR 組WBC、NEUT 以及RBC、PLT 均低于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組的WBC、LYMP、NEUT 以及RBC 與NC 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而PLT 仍明顯低于NC 組（P＜0.01，P＜0.05）。 與IR 組比較，IRA組WBC 及RBC 明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；IRYH組小鼠WBC、LYMP 和RBC 均明顯升高（均為P＜0.05）；IRYM 組LYMP、RBC 和PLT 均明顯升高（P＜0.05）；與IRA 組比較，IRYL 組的RBC 仍下降明顯（P＜0.05），益氣解毒方各組PLT 明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表1 照射前后各組小鼠體質(zhì)量（g，±s，n=8）

表1 照射前后各組小鼠體質(zhì)量（g，±s，n=8）

注: 與NC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與IR 組比較，#P＜0.05；與IRA 組比較，△△P＜0.01；與IRYM 組比較，▲P＜0.05

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值-7 d 20.45±1.94 21.25±1.15 21.37±0.92 21.52±0.78 20.99±0.95 20.72±0.59 0.280 0 d 21.98±0.38 22.09±0.33 22.41±0.62 21.50±1.20 22.10±0.76 22.05±0.63 0.606 4 d 22.49±0.86 21.45±0.20*22.46±0.85#20.81±1.50**△△▲21.62±0.40 21.38±0.60 0.009 15 d 24.78±0.77 23.06±0.09**23.68±0.39*23.56±0.75**23.60±0.66*23.44±0.73**0.017 35 d 24.57±0.88 24.32±0.74 24.66±1.09 23.70±0.68 24.33±1.04 23.75±1.25 0.238

表2 照射后第35 天各組小鼠全血細(xì)胞計數(shù)（±s，n=8）

表2 照射后第35 天各組小鼠全血細(xì)胞計數(shù)（±s，n=8）

注: 與NC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與IR 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與IRA 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值WBC/(×109·L-1)3.45±0.52 2.53±0.22*3.46±0.63#3.70±0.65#3.94±1.52 2.80±0.39 0.007 LYMP/(×109·L-1)2.82±0.60 2.05±0.03 2.60±0.21 2.84±0.43#3.53±1.42#2.45±0.30 0.025 NEUT/(×109·L-1)0.065±0.019 0.038±0.020*0.052±0.008 0.030±0.000 0.048±0.015 0.035±0.014 0.035 RBC/(×1012·L-1)10.72±0.20 10.23±0.24**10.75±0.31##10.55±0.37#10.60±0.26#10.46±0.09△0.006 PLT/(×109·L-1)821.71±80.75 502.83±41.38**468.60±23.51**623.86±94.04*△597.88±46.80**#△△609.33±65.45**△0.000

2.3 照射后第35 天各組小鼠睪丸及附睪質(zhì)量

照射后第35 天，與NC 組比較，各照射組小鼠睪丸、附睪質(zhì)量均降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與IR 組比較，IRA 組、IRYM 組睪丸質(zhì)量均明顯升高（P＜0.05），其他給藥組睪丸、附睪質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見表3。

表3 照射后第35 天各組小鼠睪丸、附睪質(zhì)量（g，±s，n=8）

表3 照射后第35 天各組小鼠睪丸、附睪質(zhì)量（g，±s，n=8）

注: 與NC 組比較，**P＜0.01；與IR 組比較，#P＜0.05

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值睪丸質(zhì)量0.193±0.008 0.130±0.009**0.141±0.007**#0.132±0.016**0.141±0.005**#0.133±0.006**0.000附睪質(zhì)量0.063±0.008 0.049±0.009**0.055±0.003**0.049±0.004**0.052±0.003**0.051±0.002**0.000

2.4 照射后第35 天各組小鼠睪丸生精上皮厚度

與NC 組比較，IR 組、IRYL 組生精上皮明顯變?。≒＜0.01，P＜0.05）；與IR 組比較，各給藥組生精上皮厚度均恢復(fù)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與IRYM 組比較，IRYL 組生精上皮厚度恢復(fù)較慢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見表4。

表4 照射后第35 天各組小鼠睪丸生精上皮厚度（±s，n=50）

表4 照射后第35 天各組小鼠睪丸生精上皮厚度（±s，n=50）

注:與NC 組比較，**P＜0.01；與IR 組比較，##P＜0.01；與IRYM 組比較，▲P＜0.05

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值生精上皮厚度/μm 68.07±9.32 26.00±9.22**62.30±3.82##63.59±5.18##68.84±7.68##59.46±9.30*##▲0.000

2.5 照射后第35 天各組小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)

NC 組生精小管結(jié)構(gòu)完好，界膜完整；生精上皮結(jié)構(gòu)清晰，各級生精細(xì)胞沿基底面向管腔面有序排列，排列緊湊，層次分明，胞核清晰，胞質(zhì)豐富，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；在生精小管的近管腔面可見大量圓形精子細(xì)胞及長形精子。與NC 組比較，IR 組睪丸嚴(yán)重?fù)p傷，其生精小管萎縮變細(xì)變形，且生精細(xì)胞層數(shù)顯著減少、生精細(xì)胞數(shù)量顯著降低，但是仍可見精原細(xì)胞和少量精母細(xì)胞；近腔面無長形和圓形精子。 與IR 組比較，IRA 組、IRYM 組損傷程度明顯改善，生精上皮層數(shù)及生精細(xì)胞數(shù)量明顯增多，可見精原細(xì)胞和大量精母細(xì)胞，生精小管的管腔中可見到少許精子細(xì)胞和長形精子。IRYH 組、IRYL 組生精小管較IR 組稍有恢復(fù)，而較IRA 組、IRYM 組恢復(fù)較慢。結(jié)果見圖1。

2.6 照射后第35 天各組小鼠附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)

NC 組小鼠附睪上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列有序，附睪管結(jié)構(gòu)清晰，管腔規(guī)則，且腔內(nèi)可見大量成熟精子。與NC 組比較，IR 組小鼠附睪管腔中精子數(shù)量顯著下降，腔內(nèi)已無長形或圓形精子，且附睪上皮有部分基細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)空泡化變性明顯。與IR 組比較，IRYM 組附睪上皮基細(xì)胞無明顯脫落，管腔內(nèi)可見較多的未成熟的圓形精子以及長形精子，且管腔內(nèi)空泡化變性顯著改善；IRA組、IRYH 組、IRYL 組小鼠精子數(shù)量恢復(fù)較慢，附睪上皮細(xì)胞中基細(xì)胞少量脫落，管腔中仍可見少量空泡。 結(jié)果見圖2。

3 討論

電離輻射導(dǎo)致的機(jī)體損傷是一種涉及多組織器官及多機(jī)制之間相互作用的復(fù)雜生物學(xué)過程。 而體質(zhì)量是輻射后綜合反映小鼠全身損傷情況以及益氣解毒方防護(hù)作用的重要指標(biāo)。 照射后第4、15 天模型組小鼠體質(zhì)量顯著下降，結(jié)合前期研究結(jié)果[9]分析，其與小鼠腸道的損傷密切相關(guān)。 而本實驗中益氣解毒方延緩了小鼠體質(zhì)量的下降速度，起到了較好的輻射防護(hù)作用。而后因為其能夠減輕腸道急性損傷程度并促進(jìn)其在短期內(nèi)快速修復(fù)[10]，縮短了小鼠體質(zhì)量恢復(fù)時間。

圖1 照射后35 天各組小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE，×400）

圖2 照射后35 天各組小鼠附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE，×400）

機(jī)體內(nèi)不同組織器官的輻射敏感性不同，受照射后，損傷程度及恢復(fù)時間不同。小鼠腸道急性輻射損傷能夠在短期內(nèi)快速修復(fù)，促進(jìn)了小鼠體質(zhì)量的恢復(fù)。 然而，部分較敏感的組織器官仍未能得到及時地修復(fù)，如造血系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。

造血系統(tǒng)對射線高度敏感，受照射后骨髓造血功能低下，導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量明顯下降。 照射后第35天，模型組小鼠全血計數(shù)顯著低下，而益氣解毒方高、中劑量組，尤其中劑量組的全血計數(shù)明顯改善，結(jié)合前期研究結(jié)果[11]，該方在預(yù)防給藥階段減輕了射線對造血系統(tǒng)的損傷；后期的治療給藥則促進(jìn)了全血中各項指標(biāo)的恢復(fù)，從而發(fā)揮了輻射防護(hù)作用。

電離輻射對生殖系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)為其對性腺器官的影響[2]239。 睪丸是雄性重要的性腺器官，兼顧生殖及內(nèi)分泌功能，輻射敏感性較高[12]。睪丸中富含高度彎曲的生精小管，其占睪丸總體積的98%[13]。輻射后生精小管萎縮變細(xì)，這可能是導(dǎo)致睪丸質(zhì)量減輕的重要因素。生精小管是由生精上皮構(gòu)成的上皮性管道。生精上皮上的生精細(xì)胞增殖分化較活躍，對電離輻射高度敏感。睪丸HE 染色切片顯示，模型組小鼠生精上皮層數(shù)以及生精細(xì)胞顯著減少，生精上皮厚度變薄。這是因為電離輻射后，各級生精細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變性壞死；同時，精原細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷后未能及時補(bǔ)充壞死脫落的生精細(xì)胞，加劇了生精上皮的損傷。而益氣解毒方中劑量組能夠明顯改善生精細(xì)胞增殖分化以及生精小管損傷情況，促進(jìn)了生精上皮的再生，有助于睪丸質(zhì)量、組織形態(tài)及生精功能的恢復(fù)。

精子分化程度較高，有相對的放射抗性[14]。照射后第35 天，附睪管中精子數(shù)降低，這是由于生精細(xì)胞嚴(yán)重壞死脫落，精子分化無源。附睪是貯存精子，并使精子獲得運(yùn)動力的重要場所。 附睪HE 切片中顯示附睪管上皮有部分基細(xì)胞脫落，腔液呈空泡化變性，這些改變會影響附睪上皮的分泌和重吸收功能，破壞精子成熟和儲存的內(nèi)環(huán)境[15]。而益氣解毒方能促進(jìn)生精功能的恢復(fù)，同時又能促進(jìn)附睪管上皮和腔液的修復(fù)，減少精子數(shù)下降。

綜上，預(yù)防加治療性給予益氣解毒方能夠促進(jìn)輻射后小鼠全血細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)，有助于生精上皮的再生，改善生精功能，且該方中劑量對小鼠睪丸組織形態(tài)和生精功能的防護(hù)作用效果更優(yōu)。