楊 卓，邱振南，余曉愉，周文佳，閆春曉，齊新宇，徐無忌，熊 輝*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.瀏陽市中醫(yī)院，湖南 瀏陽410301；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

隨著人們生活節(jié)奏的加快及交通水平的不斷提高，骨折成了臨床的常見病、多發(fā)病，各種并發(fā)癥的概率也在逐漸增加[1-2]。 由于骨折的愈合是一個(gè)漫長的過程，所以國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)中醫(yī)藥促進(jìn)骨折愈合進(jìn)行了大量相關(guān)研究[3]。 桃紅四物湯載于清代醫(yī)家吳謙所著之《醫(yī)宗金鑒》，是活血化瘀的代表方之一。本課題組前期研究表明，該方具有良好的促進(jìn)早期骨折愈合的作用，主要表現(xiàn)在促進(jìn)成骨細(xì)胞生長、加速骨小梁重建、促進(jìn)骨痂微血管新生、提高骨痂血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表達(dá)[4]。王慧卓等[5]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃桃紅四物湯后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)得血液中有效單體成分主要有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、梓醇、阿魏酸、藁本內(nèi)酯和苦杏仁苷6 種。本研究擬從桃紅四物湯中藥物主要有效單體成分配伍角度，探討其對(duì)大鼠早期骨折愈合的影響及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康2 月齡SD 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量為（200±20） g，訂購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK＜湘＞2016-0002。 各組大鼠均分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度55%～60%，自由攝食飲水。

1.2 主要藥物及試劑

4%的乙二胺四乙酸（EDTA）（上海生工生物工程有限公司），鼠VEGF 試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，G-W054），桃紅四物湯單體成分組方：苦杏仁苷（MUST-18042810）、阿 魏 酸（MUST-18032928）、羥基紅花黃色素A（MUST-18101910）、梓醇（MUST-18103011）、芍藥苷（MUST-18032901）、毛蕊花糖苷（MUST-18032725）、川芎嗪（MUST-18051403），以上成分均由成都曼斯特生物科技有限公司提供，根據(jù)2015 版《中藥藥典》的劑量將苦杏仁苷35 mg、阿魏酸2.5 mg、羥基紅花黃色素A 15 mg、梓醇3 mg、芍藥苷31 mg、毛蕊花糖苷1 mg、川芎嗪1.5 mg 溶于水配成單體組方，和桃紅四物湯水煎劑等體積灌胃。 桃紅四物湯：桃仁20 g，紅花10 g，生地黃20 g，當(dāng)歸20 g，赤芍20 g，川芎10 g，由湖南省第二附屬醫(yī)院中藥房提供，符合2015 版《中華人民共和國藥典》要求。藥物制備：加10 倍量水浸泡0.5 h，用電熱套加熱回流提取1 h，趁熱濾過；第2 次加8 倍量水，同法再煮1 h。合并兩次煎液，藥物濃縮至每1 mL中含復(fù)方中藥0.6 g。

1.3 主要儀器

ER-182 A 型電子天平（日本AND 公司），顯微鏡（日本Motic 公司 ），石蠟切片機(jī)（德國LABSTAR公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000B（上海亞榮生化儀器廠），顯微CT（美國Perkin Elmer 公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及分組

將60 只SD 雄性大鼠飼養(yǎng)1 周后，參照文獻(xiàn)[6]造模，具體方法如下：腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取俯臥位將大鼠固定于無菌操作臺(tái)上。 備皮，常規(guī)消毒。 于大鼠左股外側(cè)作一長約3 cm 的縱行切口，逐層鈍性分離后充分暴露股骨干；定位至股骨干中段，先用骨鋸鋸斷股骨，后改用止血鉗折斷股骨干，以保持?jǐn)喽送暾?。由斷端進(jìn)針，同側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子出針，于股骨干近端逆行插入一根直徑為1 mm的克氏針復(fù)位，然后順行穿回，完成復(fù)位后，彎折其根部，剪去多余部分，隨后縫合傷口。 術(shù)中剔除粉碎性骨折大鼠，重新造模補(bǔ)充至所需樣本量。 觀察大鼠情況，確認(rèn)無術(shù)后死亡后回籠飼養(yǎng)，正常飲水?dāng)z食，予青霉素腹腔注射3 d，防止感染。 將大鼠隨機(jī)分為5 組，每組12 只：空白組（A 組，不做處理，灌胃等量生理鹽水）、假手術(shù)組（B 組，只切開不截?cái)?，灌胃等量生理鹽水）、模型組（C 組，造模，灌胃等量生理鹽水）、原方水提組（D 組，造模，灌胃原方水煎劑）、單體成分組（E 組，造模，灌胃原方主要單體成分組方）。

2.2 藥物干預(yù)

大鼠每日灌胃量為3 mL/只，劑量為9 g/(kg·d)。原方水提組及單體成分組按等劑量灌胃相應(yīng)藥液；模型組、假手術(shù)組及空白組灌胃等量的生理鹽水。各組連續(xù)灌胃10 d，每天灌胃2 次，2 次灌胃間隔8 h。

2.3 樣本采集

在大鼠造模后第4、7、10 天，每組隨機(jī)選擇4 只大鼠，麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后用斷頸處死大鼠，取出左側(cè)股骨（造模處），多聚甲醛固定，固定后脫鈣。

2.4 大鼠肢體腫脹度測(cè)定

分別于造模前和造模后第4、7、10 天在左股骨中段同一位置剔除毛發(fā)，用紅線纏上進(jìn)行標(biāo)記，并用不銹鋼帶表卡尺測(cè)量，每只大鼠均需要重復(fù)3 次，得到平均值。

2.5 大鼠血清VEGF 濃度的測(cè)定

造模后第4、7、10 天使用ELISA 檢測(cè)各組大鼠血清VEGF 的濃度，每組檢測(cè)4 只，取平均值，具體操作按說明書進(jìn)行。

2.6 骨體積和骨性骨痂體積百分比測(cè)定

通過顯微CT（Micro-CT）進(jìn)行掃描，將造模后第4、7、10 天大鼠股骨中段骨折位置和骨折處周圍的骨進(jìn)行三維重建分析，可測(cè)得骨體積（bone volume, BV）和骨性骨痂體積(total volume, TV)百分比（BV/TV%）。

2.7 HE 染色觀察骨折早期斷端病理形態(tài)變化

用75%、85%、95%、100%的乙醇梯度依次脫水各30 min，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下分別觀察造模后第4、7、10 天骨折斷端病理形態(tài)變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯對(duì)大鼠肢體腫脹度的影響

與空白組比較，假手術(shù)組肢體腫脹度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組、原方水提組、單體成分組肢體腫脹度在造模后、灌胃第4、7 天大鼠肢體腫脹度均顯著增加（P＜0.05），原方水提組、單體成分組在灌胃第10 天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，單體成分組與原方水提組大鼠肢體腫脹度在造模后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在灌胃第4、7、10 天明顯降低（P＜0.05）。 與原方水提組比較，單體成分組肢體腫脹度在造模后、灌胃第4、7、10 天差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 大鼠股骨中段腫脹度變化（n=4，±s，cm）

表1 大鼠股骨中段腫脹度變化（n=4，±s，cm）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組原方水提組單體成分組灌胃第10 天4.12±0.33 4.10±0.41 4.93±0.29★4.21±0.40●4.17±0.32●造模后4.04±0.42 4.51±0.56 5.52±0.38★5.45±0.25★5.46±0.33★灌胃第4 天4.07±0.24 4.42±0.47 5.37±0.55★4.95±0.43★●4.81±0.51★●灌胃第7 天4.10±0.54 4.29±0.23 5.01±0.40★4.63±0.21★●4.72±0.53★●

3.2 桃紅四物湯對(duì)大鼠血清VEGF 濃度的影響

與空白組比較，假手術(shù)組大鼠血清VEGF 濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組、原方水提組、單體成分組大鼠血清VEGF 濃度在灌胃第4、7、10天均顯著增加（P＜0.05）。 與模型組比較，原方水提組、單體成分組大鼠血清VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天均顯著增加（P＜0.05）。 與原方水提組比較，單體成分組大鼠血清VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 不同時(shí)相點(diǎn)血清VEGF 濃度含量統(tǒng)計(jì)分析（n=4，±s）

表2 不同時(shí)相點(diǎn)血清VEGF 濃度含量統(tǒng)計(jì)分析（n=4，±s）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組原方水提組單體成分組灌胃第4 天123.65±3.61 130.17±1.67 162.32±5.34★235.18±5.09★●229.34±3.82★●灌胃第7 天122.76±2.73 125.30±2.54 197.90±7.79★335.56±4.71★●341.38±5.84★●灌胃第10 天124.04±1.89 123.15±3.01 225.68±2.54★476.74±3.82★●462.31±5.22★●

3.3 桃紅四物湯對(duì)大鼠BV、BV/TV%的影響

與模型組比較，原方水提組、單體成分組BV、BV/TV%在灌胃第4、7、10 天均顯著增加（P＜0.05）。與原方水提組比較，單體成分組BV、BV/TV%在灌胃第4、7、10 天差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3-4、圖1。

表3 大鼠術(shù)后BV 變化（n=4，±s）

表3 大鼠術(shù)后BV 變化（n=4，±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05

組別模型組原方水提組單體成分組灌胃第4 天38.12±3.64 44.35±4.59▲46.23±3.34▲灌胃第7 天42.56±3.12 53.23±3.24▲54.21±3.71▲灌胃第10 天50.12±4.72 76.43±3.89▲78.52±4.76▲

3.4 桃紅四物湯對(duì)大鼠骨組織病理結(jié)構(gòu)的影響

空白組和假手術(shù)組的骨皮質(zhì)和骨干連續(xù)未斷，可見充滿骨髓的海綿狀骨。灌胃第4 天，模型組可見不連續(xù)的骨皮質(zhì)和骨干以及局部壞死的骨組織；原方水提組和單體成分組中均可以見到少量的軟骨細(xì)胞和肉芽組織。灌胃第7 天，模型組、原方水體組、單體成分組中均可見大量軟骨細(xì)胞和肉芽組織，此外，原方水提組還可見少許骨小梁，單體成分組還可見少許的骨小梁和骨髓腔。 灌胃第10 天，模型組可見大量的軟骨細(xì)胞和肉芽組織，未見骨痂；原方水提組和單體成分組均可見少許骨痂，骨痂內(nèi)有新生骨小梁且排列致密。 見圖2。

表4 大鼠術(shù)后BV/TV%變化（n=4，±s）

表4 大鼠術(shù)后BV/TV%變化（n=4，±s）

注：與模型組組比較，▲P＜0.05

組別模型組原方水提組單體成分組灌胃第4 天0.21±0.04 0.33±0.06▲0.36±0.05▲灌胃第7 天0.24±0.05 0.47±0.02▲0.42±0.07▲灌胃第10 天0.35±0.06 0.58±0.09▲0.59±0.08▲

圖1 術(shù)后第4、7、10 天大鼠股骨顯微Micro-CT 圖像

圖2 術(shù)后第4、7、10 天大鼠股骨切片（HE，×40）

4 討論

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，是通過細(xì)胞、生長因子和生物途徑之間的相互作用來協(xié)調(diào)的[7]，通過骨折部位處募集祖細(xì)胞，促進(jìn)形成初始軟骨痂，然后被血管再吸收、骨形成和骨化最終達(dá)到骨折愈合[8]。骨折修復(fù)失敗一直是困擾骨科醫(yī)生的重要難題[9]，中醫(yī)藥治療骨傷科疾病有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其在治療骨損修復(fù)方面，一直是臨床骨科研究的重要領(lǐng)域[10]。現(xiàn)代藥理研究表明[11]，桃仁中的有效成分苦杏仁苷能發(fā)揮抗炎作用，其機(jī)制可能與通過脂蛋白刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2 中環(huán)氧合酶2，并促進(jìn)一氧化氮合酶mRNA 的表達(dá)有關(guān)。 紅花中的有效成分羥基紅花黃色素A，能拮抗二磷酸腺苷的促血小板聚集作用[12]，通過競爭性抑制血小板激活因子，正向調(diào)控VEGF 的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)血管的新生。 桃紅四物湯含有大量多糖成分，有助于增加造血微循環(huán)中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的含量，還能刺激肌組織中的造血調(diào)控因子，提高外周血中白細(xì)胞含量[13-14]。研究表明[15]，阿魏酸具有抗炎、抗血栓、抗氧化、抑制血小板聚集等藥理作用。 芍藥苷能夠抗炎止痛、擴(kuò)張血管、增加血流量、抑制血小板聚集。川芎嗪具有明顯的抗氧化損傷的作用，能增加組織中的毛細(xì)血管數(shù)，改善微血管內(nèi)血液流變性，改善損傷組織血運(yùn)狀態(tài)，加速骨折愈合。梓醇溶液能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。通過實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了桃紅四物湯單體成分配伍加速了骨折愈合[16]。

VEGF 在內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移、改善血管通透性等過程中均起重要作用。血管生成是成骨過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，VEGF 又是調(diào)控血管發(fā)育和血管生成的重要生長因子之一。因此，調(diào)控VEGF 表達(dá)是修復(fù)骨損傷和促進(jìn)骨再生的重要靶點(diǎn)之一。 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，原方水提組與單體成分組VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天均顯著升高；與原方水提組相比，單體成分組VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天未見明顯差別。證實(shí)了桃紅四物湯有效單體成分組方可以促進(jìn)VEGF 的表達(dá)。

BV/TV%及BV 是評(píng)價(jià)骨折斷端生長情況的標(biāo)志[17]。分析Micro-CT 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯單體成分組方能有效促進(jìn)大鼠早期骨折愈合。骨組織病理學(xué)檢測(cè)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，通過觀察灌胃第4、7、10 天病理切片我們發(fā)現(xiàn)，原方水提組和單體成分組大鼠軟骨細(xì)胞的生長、骨小梁與骨髓腔的形成、骨折愈合的速度均快于模型組。

綜上所述，通過對(duì)大鼠一般情況、肢體腫脹度、血清VEGF 濃度、Micro-CT 和組織病理切片的觀察、檢測(cè)和分析，本次實(shí)驗(yàn)有效證實(shí)了桃紅四物湯單體成分配伍有助于促進(jìn)大鼠骨折早期愈合，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。 此外，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果進(jìn)行分析，樣本量較小，桃紅四物湯單體成分組方是否可以完全替代原方水煎劑還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。