包三三， 王希清， 楊雨春， 武曉丹， 趙春建， 付玉杰,3*

(1.東北林業(yè)大學 化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.吉林省林業(yè)科學研究院,吉林 長春 130031； 3.北京林業(yè)大學 林學院,北京 100083)

紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)，又名海松、果松，其松籽油中富含人體所需的Δ5-多不飽和脂肪酸(Δ5-UPIFAs)，如亞麻酸、亞油酸、皮諾斂酸、棕櫚酸、二十碳五烯酸、二十碳六烯酸等[1-4]。其中皮諾斂酸是紅松籽油中特有的十八碳三烯酸，其質量約占總脂肪酸的14%～19%[5]，具有降血脂、降膽固醇和減肥等功效[6]。皮諾斂酸與其他十八碳三烯酸相比，生物活性更突出，應用前景更廣闊。但因皮諾斂酸是高度不飽和脂肪酸，穩(wěn)定性較差，而皮諾斂酸乙酯的功能與皮諾斂酸相近，且穩(wěn)定性更好、更安全，無不良氣味，更容易被人體吸收[7]，因此可通過制備皮諾斂酸乙酯作為皮諾斂酸前體物發(fā)揮其在醫(yī)藥及食品領域的應用。國內外最常用的脂肪酸乙酯的制備方法有脂肪酸乙醇酯化法和油脂乙醇醇解法。考慮到環(huán)境影響以及能源消耗等因素，在催化作用下工藝流程較短、成本較低廉、產物易于分離且收率高[8]的油脂乙醇醇解法更適于紅松籽油脂肪酸乙酯的制備。常用的脂肪酸富集純化方法主要有超臨界流體萃取法、專一性酶法、分子蒸餾法、銀離子絡合法和尿素包合法等[9-12]，其中尿素包合法因具有結構穩(wěn)定、操作簡單、溶劑和尿素都可回收再利用、環(huán)境友好等優(yōu)點，具有較強的實用性[13]。目前，已報道的尿素包合法單次富集純化紅松籽油中皮諾斂酸的純度最高只能達到45.8%～53.36%，回收率僅為27.3%[6]。本研究采用一種新型高效的油脂乙醇醇解法制備脂肪酸乙酯，并結合尿素包合法對紅松籽油中皮諾斂酸乙酯進行富集純化，通過單因素和響應面優(yōu)化試驗確定了尿素包合的最佳工藝并獲得了高純度皮諾斂酸乙酯，以期為皮諾斂酸在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的應用研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

紅松籽油由東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室提供。正己烷，色譜級；KOH、尿素、無水乙醇、氯化鈉、無水硫酸鈉，天津市天力化學試劑有限公司。

VP2002型分析天平；78HW-1型恒溫加熱磁力攪拌器；MAS-Ⅱ型微波輔助提取儀，上海新儀微波化學科技有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；Varian 450-GC/240-MS氣相色譜-質譜(GC-MS)儀，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1紅松籽油脂肪酸乙酯的制備 稱取10 g紅松籽油放入250 mL三頸燒瓶中，當油浴裝置加熱到反應所需溫度75 ℃時，分3次加入配置好的氫氧化鈉/無水乙醇溶液，其中氫氧化鈉的質量為紅松籽油質量的1.0%，無水乙醇與紅松籽油的物質的量之比為8 ∶1。啟動油浴攪拌加熱裝置并開始計時，反應全程在氮氣保護下進行，2 h后立即結束反應。將反應后的混合物倒入分液漏斗中進行萃取，首先向混合物中加入適量的正己烷，接著用5%氯化鈉溶液洗滌2次，重復3次以上操作后靜置分層。將靜置分層后的溶液放出下層水相，上層有機相用無水硫酸鈉干燥12 h后過濾，利用旋轉蒸發(fā)儀在45 ℃下旋蒸出濾液中剩余的乙醇和正己烷，最終得到紅松籽油脂肪酸乙酯。

1.2.2皮諾斂酸乙酯的分離及純化 打開微波反應器預熱30 min，將尿素和乙醇按一定比例混合在500 mL三口燒瓶中，在80 ℃下攪拌混合溶液直至澄清，反應全程在在氮氣保護下進行。然后向三口燒瓶中加入適量紅松籽油脂肪酸乙酯，反應溫度始終保持在75～80 ℃，在氮氣保護下繼續(xù)攪拌60 min直到溶液透明為止。將三頸燒瓶中的澄清溶液置于設定溫度下冷凍并結晶至設定時間后，立即將冷凍晶體抽濾。抽濾后的母液用熱的飽和鹽水和蒸餾水洗滌至中性，然后用正己烷萃取，以上操作重復3次。合并萃取后的上層溶液并用無水硫酸鈉干燥12 h，干燥后過濾除去無水硫酸鈉，通過減壓旋轉蒸發(fā)除去過量的有機溶劑，從而獲得高純度的皮諾斂酸乙酯。

1.2.3尿素回收再利用評價 尿素包合后混合物固液分離，將抽濾后得到的冷凍結晶加入一定量的蒸餾水，在100 ℃下攪拌1 h，釋放包合的脂肪酸乙酯[14]。然后向得到的混合溶液中加入正己烷萃取脂肪酸乙酯，上層為脂肪酸乙酯和正己烷，下層為尿素水溶液。將下層尿素溶液在100 ℃下繼續(xù)濃縮至幾乎無水，低溫下結晶，即可回收得到尿素晶體。

1.3 分析方法

1.3.1紅松籽油脂肪酸乙酯的成分分析 將1.2.1節(jié)制備的紅松籽油脂肪酸乙酯樣品經進樣前處理后，采用氣相色譜法分析其脂肪酸乙酯的組成。采用VF-5ms硅膠毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：150 ℃下啟動升溫程序，以10 ℃/min升至180 ℃(保持2 min)，接著以2 ℃/min升至188 ℃(保持2min)，緊接著以0.2 ℃/min升至190 ℃(保持2 min)，再以5 ℃/min升至220 ℃(保持2min)，最后以10 ℃/min升至260 ℃。進樣器溫度240 ℃；檢測器溫度290 ℃；載氣為高純度氦氣，分流比1 ∶40；燃氣為高純氫氣，助燃氣為壓縮空氣；樣品進樣量1 μL。

1.3.2皮諾斂酸乙酯純度及回收率的測定 將1.2.2節(jié)得到的皮諾斂酸乙酯樣品經過進樣前處理后，采用氣相色譜測定皮諾斂酸乙酯的純度。采用VF-5ms硅膠毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；烘箱升溫程序：150 ℃下啟動升溫程序，然后以5 ℃/min升至185 ℃后恒溫保持2 min，接著以0.2 ℃/min升溫至192 ℃后恒溫保持2min，最后以10 ℃/min升溫至280 ℃。氫火焰離子檢測器；進樣口溫度和檢測器溫度分別為240 ℃和290 ℃；載氣為高純度氦氣，分流比為1 ∶40；燃氣為高純氫氣，助燃氣為壓縮空氣；樣品進樣量1 μL。皮諾斂酸乙酯GC含量(ω，%)及回收率(η,%)按式(1)～式(2)計算：

ω=A0/As×100%

(1)

η=m0/m1×100%

(2)

式中：A0—皮諾斂酸乙酯峰面積；As—紅松籽油脂肪酸乙酯峰面積；m0—包合后皮諾斂酸乙酯質量，g；m1—包合前皮諾斂酸乙酯質量，g。

2 結果與討論

2.1 紅松籽油脂肪酸乙酯成分分析

通過GC-MS分析酯化反應后紅松籽油中的脂肪酸乙酯成分，將分析結果與NIST05標準譜庫檢索比對，確定出紅松籽油脂肪酸乙酯成分及GC含量見表1。由表1可知，紅松籽油混合脂肪酸乙酯中不飽和脂肪酸乙酯的GC含量約為97.67%，其中皮諾斂酸乙酯GC含量約為15.57%。

表1 紅松籽油脂肪酸乙酯組成及含量

2.2 不同條件對皮諾斂酸乙酯純化效果的影響

2.2.1尿素與混合脂肪酸乙酯質量比 在乙醇與尿素比例5 ∶1(mL ∶g，下同)、結晶溫度為-20 ℃、結晶時間為24 h條件下，考察尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質量比對純化效果的影響(每組實驗重復3次)，結果見圖1(a)。由圖可知，尿素用量對富集效果影響顯著，當尿素與脂肪酸乙酯質量比為3 ∶1時，皮諾斂酸乙酯GC含量達到最大值。這是因為尿素用量過少時，形成尿素包合物的框架少，不能最大程度地包合飽和或單不飽和脂肪酸乙酯，富集效果差；用量增加時，更多的飽和或單不飽和脂肪酸乙酯被尿素包合，使得多不飽和脂肪酸乙酯即皮諾斂酸乙酯GC含量相應提高；但是當尿素用量達到一定程度后繼續(xù)增加尿素用量，會造成尿素過量而皮諾斂酸乙酯GC含量相對減少。綜含考慮皮諾斂酸乙酯的含量及溶劑消耗，尿素與脂肪酸乙酯質量比宜選擇3 ∶1。

2.2.2乙醇與尿素比例 乙醇與尿素比例是影響尿素包合效果的重要因素之一。在尿素與脂肪酸乙酯質量比3 ∶1、結晶溫度-20 ℃、結晶時間24 h條件下，考察乙醇與尿素比例對皮諾斂酸乙酯純化效果的影響(每組實驗重復3次)，結果見圖1(b)。由圖可知，乙醇與尿素比例從4 ∶1(mL ∶g，下同)增加到6 ∶1 時，皮諾斂酸乙酯GC含量逐漸升高；當乙醇與尿素比例超過6 ∶1時，皮諾斂酸乙酯的含量卻逐漸下降。在前期實驗中發(fā)現(xiàn)溶劑量少時，很難完全溶解尿素，溶液的分子運動阻力增大；當溶劑過量時，尿素包合反應沿逆方向進行，這也會導致皮諾斂酸乙酯的含量逐漸降低，同時還將增加溶劑回收的難度。因此，在接下來實驗中乙醇與尿素比例宜選擇6 ∶1。

2.2.3包合溫度 合適的包合溫度在尿素包合過程中起著至關重要的作用。在乙醇與尿素比例6 ∶1、尿素與脂肪酸乙酯質量比3 ∶1、結晶時間24h條件下，考察包合溫度對純化效果的影響(每組實驗重復3次)，結果見圖1(c)。由圖可知，當包合溫度為-10 ℃時，皮諾斂酸乙酯GC含量達到最大值；而當溫度升高到0 ℃以上時，含量急劇下降。該現(xiàn)象歸因于尿素包合反應是放熱過程，溫度升高則尿素包合物逐漸分解，導致尿素包合效果差；當溫度低時反應朝著尿素包合物形成的方向進行。但是，溫度過低，過濾困難，脂肪酸損失大，這也會導致尿素包合效果變差。因此，綜合考慮反應能耗和皮諾斂酸乙酯GC含量，合適的包合溫度為-10 ℃。

a.m(尿素)/m(脂肪酸乙酯)m(urea)/m(fatty acid ethyl esters); b.乙醇與尿素比 ratio of ethanol to urea;

2.2.4包合時間 反應時間在反應過程中也起著重要的作用。在乙醇與尿素比例6 ∶1、尿素與脂肪酸乙酯質量比3 ∶1、包合溫度-10 ℃的條件下，考察包合時間對純化效果的影響(每組實驗重復3次)，結果見圖1(d)。由圖可知，包合時間總體上對皮諾斂酸乙酯GC含量的影響不顯著。皮諾斂酸乙酯GC含量在包合時間為24 h達到最大值，繼續(xù)延長包合時間，皮諾斂酸乙酯的GC含量降低。這是因為包合反應在24 h達到平衡，繼續(xù)延長包合時間，反應向相反方向進行。故最佳反應時間為24 h。

2.3 皮諾斂酸乙酯純化的響應面優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，以皮諾斂酸乙酯GC含量(Y)為響應值，影響較為顯著的3個因素：尿素與脂肪酸乙酯質量比(X1)、乙醇與尿素比例(X2)、包合溫度(X3)為自變量進行響應面優(yōu)化試驗，試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

根據(jù)Box-Behnken試驗所得到的數(shù)據(jù)結果和回歸方程，利用Design Expert 8.0.6軟件分析皮諾斂酸乙酯最佳純化工藝，得到皮諾斂酸乙酯GC含量的二次回歸模型方程為：Y=-893.085+149.495X1+242.236X2-7.096X3+0.617X1X2+0.054X1X3+0.044X2X3-25.692X12-20.444X22-0.262X32。對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸方程方差分析

從表3的模型方差分析中可以看出，本試驗的回歸方程模型P<0.05具有顯著性，失擬項不顯著(P=0.1051>0.05)，表明該模型擬合成功[15-16]。根據(jù)回歸方程繪制皮諾斂酸乙酯GC含量隨各影響因素變化的響應曲面圖，結果見圖2。尿素包合法中任意2個顯著性影響因素所形成的響應曲面均呈現(xiàn)中心凸起四周下降的趨勢，說明尿素包合法富集純化皮諾斂酸乙酯實驗中響應面選取水平范圍準確，并且存在皮諾斂酸乙酯GC含量的最大值，通過模型預測的最佳純化工藝科學合理。

通過軟件分析，該回歸方程擬合的皮諾斂酸乙酯GC含量達到最大值時的工藝條件為：尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質量比3.04 ∶1，乙醇與尿素比例5.99 ∶1(mL ∶g)，包合溫度-12.85 ℃，模型預測的皮諾斂酸乙酯GC含量最高為94.84%。為了驗證擬合結果并考慮到實際操作的可行性，在尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質量比3 ∶1、乙醇與尿素比例6 ∶1(mL ∶g)、包合溫度-13 ℃和包合時間24 h條件下進行3組驗證性試驗，得到皮諾斂酸乙酯平均GC含量為94.75%，回收率為66.25%。實際驗證值與理論預測值非常接近，說明響應面法優(yōu)化皮諾斂酸含量的條件真實可靠。

a.Y=f(X1, X2)； b.Y=f(X1, X3)； c.Y=f(X2, X3)

對回收尿素重復包合、分離、再包合過程進行了考察，通過對尿素3次包合和回收后，得到皮諾斂酸乙酯的純度依次為94.75%、88.37%、72.72%，回收率依次為66.25%、61.24%、50.62%。皮諾斂酸乙酯平均純度仍可達85.28%，雖然純度略有所下降，但證明尿素仍有較好的重復利用性。

2.4 與傳統(tǒng)純化皮諾斂酸方法的對比

圖3 新工藝純化皮諾斂酸乙酯GC含量Fig.3 GC content of pinolenic acid ethyl ester purified by the novel technology

圖3為本工藝富集純化出的皮諾斂酸乙酯的GC圖。尿素是一種四方系的晶體，當尿素與脂肪族化合物生成包合物后，包合物呈六棱柱的結晶。一般飽和脂肪酸乙酯和單不飽和脂肪酸乙酯可進入尿素形成的六棱柱空管道中，比多不飽和脂肪酸乙酯更容易形成穩(wěn)定的包合物，最終通過減壓抽濾法除去包合物就可以得到高純度的多不飽和脂肪酸乙酯。傳統(tǒng)尿素包合法純化皮諾斂酸的方法較為繁瑣，首先將紅松籽油經過皂化反應制備紅松籽油混合脂肪酸鹽，再經酸化得到紅松籽油混合脂肪酸，接著采用尿素包合法富集純化皮諾斂酸，最后再對皮諾斂酸采用甲酯化或乙酯化處理后經過氣相色譜檢測其純度。楊明非等[6]經此方法得到皮諾斂酸純度約為45.8%，回收率約為27.3%。本實驗利用新工藝純化皮諾斂酸乙酯只包含2個步驟：采用乙醇醇解油脂法制備紅松籽油混合脂肪酸乙酯，再優(yōu)化尿素包合法富集純化皮諾斂酸乙酯。純化后得到的皮諾斂酸乙酯無需再經過甲酯化或者乙酯化處理，可直接利用氣相色譜進行純度檢測。相比傳統(tǒng)方法省去較多實驗步驟，有效減少了實驗過程中皮諾斂酸的損失，且以乙酯形式存在的脂肪酸在實驗條件下結構更加穩(wěn)定，有利于富集純化過程的進行。本工藝富集純化出的皮諾斂酸乙酯純度可高達94.75%，回收率可達66.25%，可以看出，相比傳統(tǒng)方法[6]，皮諾斂酸乙酯純度提高107%，回收率提高143%。

3 結 論

本研究結合乙醇醇解油脂反應和尿素包合法，將紅松籽油中皮諾斂酸以脂肪酸乙酯的形式進行了高效的富集純化，采用單因素和響應面試驗優(yōu)化了純化工藝。結果表明：皮諾斂酸乙酯的最佳純化工藝條件為尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質量比3 ∶1、乙醇與尿素比例6 ∶1(mL ∶g)、包合溫度-13 ℃和包合時間24 h，此條件下分離純化出皮諾斂酸乙酯純度高達94.75%，回收率達66.25%。與傳統(tǒng)尿素包合法純化皮諾斂酸相比，純度提高107%，回收率提高近143%，并且尿素在回收實驗中表現(xiàn)出較好的回收利用性。本方法克服了常規(guī)富集純化皮諾斂酸方法中實驗步驟復雜且純度不高的缺點，建立了一種高效富集純化紅松籽油中皮諾斂酸乙酯的新工藝，將為后續(xù)皮諾斂酸在相關食品、醫(yī)藥、保健領域的應用提供數(shù)據(jù)基礎和技術支持。