王景超 程彬 于曉菲 齊云 于軍 張君 張娟

摘要 利用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)玉米中的35個(gè)ARF家族基因在雌花序不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。利用Genevestigator網(wǎng)站中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，分析發(fā)現(xiàn)，玉米7個(gè)不同發(fā)育時(shí)期均有1到多個(gè)ARF基因表達(dá)，表明ARF家族基因在玉米不同發(fā)育時(shí)期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)還顯示，每個(gè)ARF基因均在玉米花序發(fā)育時(shí)期具有較高表達(dá)水平。為了探究玉米雌花序發(fā)育過(guò)程中ARF基因家族的表達(dá)模式，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)玉米ARF家族成員在雌花序不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。根據(jù)ARF基因的表達(dá)模式，可將這35個(gè)基因分成4類：第1類的15個(gè)ARF基因在小穗對(duì)原基（SPM）時(shí)期高表達(dá);第2類的13個(gè)ARF基因在小穗原基（SM1）時(shí)期高表達(dá);第3類的6個(gè)ARF基因在花器官原基（F）時(shí)期高表達(dá);第4類的1個(gè)ARF基因在花原基（FM）時(shí)期高表達(dá)。研究結(jié)果表明，玉米ARF家族基因在雌花序不同發(fā)育時(shí)期發(fā)揮重要作用。該研究將為解析玉米ARF家族基因在雌花序生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能提供重要信息。

關(guān)鍵詞 ARF;雌花序;表達(dá);玉米

中圖分類號(hào) S513? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）24-0132-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.031

Expression Analysis of ARF Family Genes in Female Inflorescence Development of Maize

WANG Jing-chao， CHENG Bin， YU Xiao-fei et al

（Shandong Product Quality Inspection Research Institute， Jinan， Shandong 250100）

Abstract In this study， we analyzed the expression patterns of 35 members of this gene family in female inflorescences at different developmental stages.Using the information of the transcriptome database in Genevestigator website， it was found that one or more ARF genes were expressed in maize at seven different developmental stages， indicating that ARF family genes regulate different developmental processes cooperatively. In addition， each ARF gene was expressed at a high level during inflorescence development. In order to explore the role of ARF family members in the development of female inflorescences of maize， we used real-time quantitative PCR to detect gene expression levels in six female inflorescences at different developmental stages. According to the expression pattern of ARF gene， the 35 ARF genes could be divided into four classes： the first class， 15 ARF genes were highly expressed in spikelet-pair meristem （SPM）;in the second class， 13 ARF genes were highly expressed in spikelet meristem （SM1）. Six ARF genes of the third class were highly expressed in flower organ meristem （F） stage， and one ARF gene of the fourth class was highly exprossed in floral primorclium （FM） stage. These results indicated that ARF gene plays an important role in the development of female inflorescence in maize. The results of this study will provide important information for studying the function of ARF gene in the development of female inflorescence in maize.

Key words ARF;Female inflorescence;Expression;Maize

作者簡(jiǎn)介 王景超（1988—），男，山東濟(jì)南人，工程師，從事肥料檢測(cè)研究。

通信作者，研究員，從事肥料檢測(cè)研究。

收稿日期 2021-08-16;修回日期 2021-08-19

生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程涉及多種早期響應(yīng)基因，如GH3、AUX/IAA、SAUR基因家族和能與生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxREs）相互作用的生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF（auxin response factor）基因家族[1]。ARF基因調(diào)控生長(zhǎng)素參與許多生物學(xué)過(guò)程，如向性運(yùn)動(dòng)、頂端優(yōu)勢(shì)等[2-4]。研究顯示，ARF基因家族存在于雙子葉和單子葉植物中，但在其他生物物種中卻并未發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明ARF基因家族是特異存在于植物中的一類基因[5]。擬南芥中有22個(gè)ARF成員[6]，其中MP/ARF5蛋白在胚胎發(fā)生與維管形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2]，NPH4/ARF7蛋白影響擬南芥植株的向光性和向重力性[3]。此外，水稻中的OsARF1受生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)，參與胚芽鞘的向性運(yùn)動(dòng)[4]。通過(guò)玉米全基因組序列比對(duì)分析，共得到35個(gè)ARF候選基因，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、染色體位置和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了分析[7]，但對(duì)基因生物學(xué)功能的研究相對(duì)較少。生長(zhǎng)素合成基因YUC家族和轉(zhuǎn)運(yùn)基因PIN家族均在玉米雌花序原基的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用[8-10]，但ARF基因家族在玉米雌花序生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，筆者利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)35個(gè)玉米ARF基因在不同發(fā)育時(shí)期雌花序中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，以期為解析玉米ARF基因家族在雌花序生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參照李文蘭等[9]的取材時(shí)期，對(duì)處于花序原基、小穗對(duì)原基、小穗原基早期、小穗原基后期、花原基期和花器官原基期6個(gè)不同時(shí)期的雌花序分別取材，迅速用液氮進(jìn)行冷凍，并置于-80 ℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)定量PCR分析。試驗(yàn)選用的材料是玉米B73自交系。

1.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR分析

利用Trizol試劑提取不同樣品的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的提示完成cDNA的合成與純化。利用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)定量檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）對(duì)不同樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，所用的定量引物序列見(jiàn)表1。將玉米的18S rRNA基因作為實(shí)時(shí)定量PCR的內(nèi)參基因。得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行差異性分析。

1.3 利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)ARF基因進(jìn)行表達(dá)分析

通過(guò)玉米ARF基因的ID號(hào)（來(lái)源于MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)）在Genevestigator網(wǎng)站（http：//www.genevestigator.com/gv/）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得玉米ARF家族基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ARF家族基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式

為了探究玉米ARF家族基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，利用Genevestigator網(wǎng)站中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的信息分析了ARF家族基因在7個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（灌漿期、果穗形成期、萌發(fā)期、開(kāi)花期、花序形成期、莖伸長(zhǎng)期和幼苗期）的表達(dá)水平。從圖1可見(jiàn)，除了ARF9、ARF19、ARF26和ARF28這4個(gè)基因的表達(dá)信息未檢測(cè)到，其他31個(gè)玉米ARF基因的表達(dá)信息均有獲得。在檢測(cè)的7個(gè)不同發(fā)育時(shí)期，均有1到多個(gè)ARF基因有表達(dá)，說(shuō)明ARF家族基因在玉米不同發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用，并且這些ARF基因在花序發(fā)育過(guò)程均有較高水平表達(dá)，而李文蘭等[12]的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，多個(gè)玉米ARF基因均在花序中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，推測(cè)玉米ARF基因在花序發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。

2.2 玉米ARF家族基因在雌花序發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

玉米雌花序的發(fā)育通常與產(chǎn)量密切相關(guān)。前人研究表明，生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因YUC家族和生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因PIN家族在雌花序原基的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用[9]。為了探究玉米ARF家族基因在雌花序不同發(fā)育時(shí)期的作用，筆者通過(guò)qRT-PCR技術(shù)對(duì)35個(gè)玉米ARF家族基因在6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期雌花序中的基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。

從圖2可見(jiàn)，根據(jù)ARF基因在雌穗發(fā)育6個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)模式，可將這35個(gè)基因分成4類。第1類包括ARF3、ARF4、ARF8、ARF9、ARF10、ARF12、ARF14、ARF17、ARF23、ARF25、ARF26、ARF27、ARF29、ARF31和ARF33這15個(gè)基因，在SPM時(shí)期高表達(dá);第2類包括13個(gè)基因，分別是ARF1、ARF2、ARF5、ARF6、ARF7、ARF11、ARF13、ARF18、ARF20、ARF21、ARF22、ARF24和ARF30，在SM1時(shí)期高表達(dá);第3類包含6個(gè)基因，分別是ARF15、ARF19、ARF28、ARF32、ARF34和ARF35，在F時(shí)期高表達(dá);第4類包含1個(gè)基因ARF16，在FM時(shí)期高表達(dá)。SPM時(shí)期是小穗對(duì)原基形成期，SM1時(shí)期是小穗原基形成期，F(xiàn)時(shí)期是花器官原基形成期，ARF基因在這4個(gè)時(shí)期高表達(dá)，表明ARF基因在玉米雌花序發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3 討論與結(jié)論

生長(zhǎng)素是植物側(cè)生器官與腋生原基起始的一種重要信號(hào)[13]。ARF基因作為一類生長(zhǎng)素響應(yīng)因子，通過(guò)與生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxREs）相互作用來(lái)激活或抑制生長(zhǎng)素調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[14]。擬南芥中的ARF17精細(xì)調(diào)控花藥發(fā)育和花粉形成[15]，ARF2-5是雌雄配子體發(fā)育所必需的[16];黃瓜中的Csa019264和Csa019265（AtARF8的同源基因）在單性結(jié)實(shí)和非單性結(jié)實(shí)品種中的表達(dá)水平差異大，可能參與了果實(shí)的發(fā)育和形態(tài)建成[17]。以上結(jié)果表明，ARF基因家族在生殖器官發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且在花序發(fā)育過(guò)程中的功能相對(duì)保守。

前人研究表明，玉米中有35個(gè)ARF基因[7]。筆者利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)玉米35個(gè)ARF成員在不同發(fā)育時(shí)期雌花序中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，有15個(gè)ARF基因在SPM時(shí)期高表達(dá)，有13個(gè)ARF基因在SM1時(shí)期高表達(dá)，有6個(gè)ARF基因在F時(shí)期高表達(dá)，有1個(gè)ARF基因在FM時(shí)期高表達(dá)，表明玉米ARF基因參與雌花序不同發(fā)育時(shí)期的調(diào)控過(guò)程，也印證了ARF基因在花序發(fā)育過(guò)程中的功能保守。

通過(guò)對(duì)ARF家族基因在玉米雌花序發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ARF家族基因主要在玉米雌花序發(fā)育的小穗對(duì)原基期、小穗原基早期和花器官原基期中具有較高的表達(dá)量，表明ARF基因在雌花序各類原基形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

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