馬佳菲，秦 臻，范立強，趙黎明,*，蔣麗華，*

(1.華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院/發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心/生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237； 2.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 上海 201900)

氨基葡萄糖(glucosamine，GlcN)是天然的氨基單糖，在自然界中廣泛存在，其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)是甲殼素(又稱為幾丁質(zhì))的結(jié)構(gòu)單元。GlcN是唯一的堿性單糖，游離的氨基使其具有生物活性。GlcN不僅可用于治療關(guān)節(jié)炎，促進關(guān)節(jié)生理活性的正常運行[1-4],而且具有多種生物活性，如抗癌[5-7]、抗氧化[8-11]、抑菌[12-13]、抗病毒[14]等。GlcN已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、飼料、保健食品、化妝品等領(lǐng)域中。

GlcN的廣泛使用促使其需求量不斷增加，刺激了其工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。目前GlcN的生產(chǎn)方法有酸水解法、微生物發(fā)酵法和生物催化法。傳統(tǒng)的甲殼素酸水解法[15-17]需在高溫條件下，并在濃酸中進行水解，存在環(huán)境污染嚴(yán)重、設(shè)備要求高等問題。通過微生物發(fā)酵法制備GlcNAc[18-19],并進一步脫乙?；@得GlcN，已逐漸成為規(guī)?；镏圃霨lcN的主要途徑；然而該方法的脫乙酰反應(yīng)仍需要采用酸水解來實現(xiàn)。Deng等[20-21]還報道了微生物發(fā)酵法直接生產(chǎn)GlcN，但在發(fā)酵過程中，GlcN降解速度快，且GlcN及其降解產(chǎn)物對宿主細(xì)胞具有抑制作用，導(dǎo)致產(chǎn)量較低。Jiang等[22-23]報道了以GlcNAc為底物，全細(xì)胞催化生產(chǎn)GlcN，此方法環(huán)境污染少，但仍未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的需求?；谝延械纳a(chǎn)方法，利用微生物發(fā)酵法得到的GlcNAc，再利用一種環(huán)境友好、成本低、生產(chǎn)效率高且工藝簡單的生物酶催化法將GlcNAc脫乙?；a(chǎn)GlcN，將是一種更理想的GlcN生產(chǎn)方法。

已報道的可應(yīng)用于GlcN生產(chǎn)的脫乙酰酶存在反應(yīng)溫度高、底物親和力差等問題；因此，挖掘穩(wěn)定性好、反應(yīng)條件溫和、底物親和力高的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶具有重要的意義。來源于Cyclobacteriummarinum的脫乙酰酶CmCBDA是第一個報道的能夠在體外溫和條件下催化GlcNAc脫乙酰基生成GlcN的酶，且能耐受較高的底物濃度[24]。本研究擬利用生物信息學(xué)手段篩選與CmCBDA氨基酸序列相似性最高的卡西氏菌Cyclobacteriumqasimii來源脫乙酰酶(CqCBDA)，對CqCBDA的編碼基因進行克隆、表達(dá)及純化，并進行酶學(xué)性質(zhì)表征，以期為工業(yè)化生產(chǎn)GlcN提供具有應(yīng)用價值的生物酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cyclobacteriumqasimii脫乙酰酶基因CqCBDA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；大腸桿菌(E.coli)DH5α和BL21(DE3)感變態(tài)細(xì)胞，購自上?？禐樵噭┥锟萍脊?；帶有卡那霉素抗性基因的載體pET28a(+)，購自美國Novagen有限公司；Taq DNA聚合酶，購自南京Vazyme生物科技有限公司；T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶，購自美國New England Biolabs有限公司；DNA Marker DL2000和蛋白 Marker，購自大連TaKaRa生物工程有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；N-乙酰氨基葡萄糖，購自上海麥克林生化科技有限公司。

LB液體培養(yǎng)基：5 g酵母提取物，10 g胰蛋白胨，10 g NaCl，用去離子水定容至1 L。LB固體培養(yǎng)基：5 g酵母提取物，10 g胰蛋白胨，10 g NaCl，20 g瓊脂粉，用去離子水定容至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀、Power Pac Basic電泳儀，美國Bio-Rad公司；JY92- IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV765型紫外- 可見分光光度計，上海佑科儀器有限公司；1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1基因序列篩選與分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的已報道的具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的Cyclobacteriummarinum來源脫乙酰酶基因CmCBDA的編碼序列(GenBank登錄號：WP_149392827)，利用BlastP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析其與其他蛋白的序列相似性，篩選得到Cyclobacteriumqasimii來源的具有潛在N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的CqCBDA基因序列(GenBank登錄號：WP_020891027)。使用DNAMAN軟件分析CqCBDA核酸序列并確定酶切位點，并使用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中脫乙酰酶氨基酸序列，使用MEGA 7.0軟件按照 Neighbor- joining運算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[25]，使用ClustalX2軟件進行多重序列比對。

1.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.3重組CqCBDA的表達(dá)與純化

將含有重組質(zhì)粒pET- 28a- CqCBDA的陽性工程菌接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，用緩沖液A(20 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH值8.0)重懸，超聲破碎后10 000 r/min離心10 min，得到的上清液即為含有可溶性重組蛋白的粗酶液。將粗酶液上樣至預(yù)先平衡好的Ni-IDA柱后，先用緩沖液A和緩沖液B(40 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH值8.0)洗滌，再用緩沖液C(200 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH值8.0)沖洗，收集帶有組氨酸標(biāo)簽(Histidine tag，His-tag)的重組CqCBDA。SDS- PAGE法檢測重組蛋白表達(dá)純化效果。

1.3.4酶學(xué)性質(zhì)表征

1.3.4.1 蛋白定量和酶活力的檢測

1)蛋白定量檢測[26]。以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。在1 mL的考馬斯亮藍(lán)試劑中，加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，迅速混勻，室溫反應(yīng)3 min后，以加入等量蒸餾水的試劑作為空白對照。使用分光光度計檢測樣品在595 nm波長下的吸光值，根據(jù)測得的吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出純酶中的蛋白濃度。

薄層層析色譜法(thin-layer chromatography，TLC)定性檢測得到的可溶性重組酶是否具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性。TLC條件：展開劑為異丙醇、水和氨水混合液(三者體積比為15.0∶1.0∶7.5)；顯色劑的配制方法為，將適量的大茴香醛溶于乙醇中，緩緩加入少量的濃H2SO4，再加入少量的醋酸混合，展開時間為60 min。

2)酶活力檢測。將270 μL用緩沖液配制而成的10 g/L GlcNAc溶液在水浴鍋中預(yù)熱2 min，然后加入30 μL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)10 min，立即沸水浴加熱5 min終止反應(yīng)。采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測反應(yīng)液中GlcN的濃度，計算酶活力。

酶活力單位(U)定義：在酶促反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmoL GlcN(N-乙酰氨基葡萄糖)所需的脫乙酰酶酶量。

HPLC條件[27]：色譜柱為氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為195 nm；流動相為體積分?jǐn)?shù)為35%的水相(稱取3.5 g K2HPO4，加水溶解，加入0.25 mL氨水，混勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.5，用水定容至1 L)和65%的乙腈，流速為1 mL/min；色譜柱溫度為35 ℃；進樣量為10 μL。

1.3.4.2 最適溫度和熱穩(wěn)定性的測定

重組CqCBDA在不同溫度(25～60 ℃)下分別進行反應(yīng)，測定其酶活力。以測得的最高酶活力為100%，計算不同溫度下的相對酶活力，確定該酶的最適溫度。

以未經(jīng)處理的酶液的酶活力為100%，將重組CqCBDA分別置于不同溫度(30～80 ℃)下孵育60 min后，在最適溫度下測定殘余酶活力，確定該酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4.3 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的測定

重組CqCBDA在不同pH值(pH值為6.0～10.0)的緩沖液中，在最適溫度下分別進行反應(yīng)，測定其酶活力。以測得的最高酶活力為100%，計算不同pH值條件下的相對酶活力，確定該酶的最適pH值。

以未經(jīng)處理的酶液的酶活力為100%，將重組CqCBDA分別置于不同pH值(pH值為6.0～10.0)的緩沖液中，在最適溫度條件下孵育60 min后，在最佳反應(yīng)條件下測定殘余酶活力，確定該酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.3.4.4 動力學(xué)參數(shù)的測定

為了測定重組CqCBDA的動力學(xué)參數(shù)，將其分別置于不同質(zhì)量濃度(0.25～64.00 mg/mL)的GlcNAc溶液中，在最適反應(yīng)條件下進行反應(yīng)，測定其酶活力。通過Sigma plot軟件計算Vmax和Km值，從而計算出Kcat值和Kcat/Km值。

1.3.4.5 金屬離子和EDTA對酶活力影響的測定

在反應(yīng)液中分別加入終濃度為10 mmol/L的不同金屬離子(Ni2+、Mn2+、Ca2+、K+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Cu2+、Zn2+)和EDTA，以不加金屬離子的酶液的酶活力為100%，測定金屬離子和EDTA對重組CqCBDA酶活力的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用軟件MEGA7.0和Clustacx2進行氨基酸序列分析，采用軟件Origin 9.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 CqCBDA的序列分析結(jié)果

為了篩選得到具有N-氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的脫乙酰酶，利用Blast比對CmCBDA與其他蛋白的序列相似性，得到Cyclobacteriumqasimii來源的脫乙酰酶基因(CqCBDA)，基因全長879 bp，編碼292個氨基酸。Blast分析結(jié)果顯示：CqCBDA氨基酸序列與CmCBDA序列相似度最高，達(dá)78.40%。圖1為CqCBDA的序列分析結(jié)果，圖1(a)的CqCBDA氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹同樣顯示：CqCBDA與CmCBDA具有最近的進化關(guān)系。

CqCBDA多重序列比對包括：海環(huán)桿菌(WP_149392827)、幽門螺桿菌(WP_111636464.1)以及鼠尾菌(WP_108424554.1、WP_119608117.1)來源的脫乙酰酶。圖上方的數(shù)字表示氨基酸的殘基序號；保守的氨基酸標(biāo)以紅色陰影，活性中心的兩個催化氨基酸殘基(His230和Arg253)以星號標(biāo)注。圖1 CqCBDA的序列分析結(jié)果Fig.1 Results of sequence analysis of CqCBDA

圖1(b)為CqCBDA與Ydjc家族其他來源的脫乙酰酶多重序列比對結(jié)果。圖1(b)顯示：有多處高度保守的氨基酸序列重合[28]，如與產(chǎn)物乙酸分子的氧原子形成氫鍵的Arg253，與乙酸分子的另一個氧原子形成氫鍵的His230，尤其是與Ydjc家族脫乙酰酶氨基酸序列中高度保守的Asp22、His72和His143氨基酸殘基也完全一致；因而，推斷CqCBDA可能歸屬于Ydjc家族。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

以含目的基因的菌體作為模板，進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2。圖2顯示：PCR擴增得到一條900 bp左右的特異性條帶，其大小符合理論預(yù)期，與CqCBDA基因大小一致。經(jīng)雙酶切的基因和表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測序鑒定，成功構(gòu)建并得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET- 28a- CqCBDA。

M：DNA Marker；1：PCR擴增產(chǎn)物。圖2 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gelelectrophoresis result of gene fragment

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果

表達(dá)質(zhì)粒pET- 28a- CqCBDA轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞后，在LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用Ni- IDA親和層析柱對上清液中的可溶性目的蛋白進行純化。通過SDS- PAGE分析蛋白表達(dá)情況和純度，蛋白凝膠電泳結(jié)果如圖3。圖3顯示：全細(xì)胞液和上清液中均含有33 kDa大小的條帶，與目的蛋白分子質(zhì)量大小相同，表明已成功表達(dá)了可溶性重組目的蛋白；可溶性蛋白的含量較高，且成功獲得高純度的可溶性目的蛋白。

M：蛋白marker；1：全細(xì)胞液；2：超聲破碎上清液；3：超聲破碎沉淀；4：純化的目的蛋白。圖3 重組CqCBDA的表達(dá)和純化結(jié)果Fig.3 Results of expression and purification of recombinant CqCBDA

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1重組CqCBDA的催化活性

以適當(dāng)濃度的GlcNAc溶液作為反應(yīng)底物，檢測重組CqCBDA的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性，TLC檢測結(jié)果如圖4。圖4顯示：隨著反應(yīng)時間的延長，GlcN的顏色加深，GlcNAc的顏色變淺，說明GlcNAc不斷脫乙酰基生成GlcN，這表明重組CqCBDA具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性。

圖4 重組CqCBDA的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰 酶活性的TLC檢測結(jié)果Fig.4 TLC analysis of recombinant CqCBDA N-acetylglucosamine deacetylase activity

GlcNAc和GlcN的高效液相色譜圖如圖5。圖5顯示：GlcNAc和GlcN的出峰時間分別為4.925 min和8.259 min，兩者的出峰時間差距較大，說明GlcNAc和GlcN能很好地分離。以GlcNAc為底物，重組CqCBDA的比酶活力為11.5 U/mg。

圖5 GlcNAc和GlcN的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of GlcNAc and GlcN

2.4.2溫度對重組CqCBDA酶活力的影響

在不同溫度下測定酶活力，重組CqCBDA的最適溫度測定結(jié)果如圖6。圖6顯示：CqCBDA的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在該反應(yīng)溫度下酶活力達(dá)到最大值。當(dāng)溫度低于30 ℃或高于45 ℃時，CqCBDA的相對酶活力降低至50%以下；當(dāng)溫度高于50 ℃時，酶活力大幅度降低，相對酶活力降至10%以下。GlcN不穩(wěn)定，會發(fā)生褐變，尤其是在較高溫度下會加速褐變和副反應(yīng)的發(fā)生，且溫度越高褐變越明顯[29]。已報道的、可應(yīng)用于GlcN生產(chǎn)的脫乙酰酶屬于高溫酶[22],在溫度較高條件下進行反應(yīng)，GlcN褐變損失增加。CqCBDA能在溫和條件下催化GlcNAc脫乙酰基生產(chǎn)GlcN，減少褐變損失。

將酶液在30～80 ℃條件下孵育60 min，測定其殘余酶活力。重組CqCBDA的熱穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖6(b)。圖6(b)顯示：當(dāng)孵育溫度低于40 ℃時，CqCBDA具有高穩(wěn)定性，其殘余酶活力仍能保持在90%以上；當(dāng)孵育溫度高于40 ℃時，穩(wěn)定性出現(xiàn)大幅度下降，這說明CqCBDA不耐高溫。

2.4.3pH值對重組CqCBDA酶活力的影響

在不同pH值條件下測定酶活力，重組CqCBDA的最適pH值測定結(jié)果如圖7。圖7(a)顯示：CqCBDA的最適反應(yīng)pH值為7.6，在該pH值條件下酶活力達(dá)到最大值；當(dāng)pH值在6.8～7.6時，CqCBDA的活性較高，其相對酶活力均在80%以上；當(dāng)pH值小于6.4或大于8.0時，CqCBDA的相對酶活力降低至60%以下。GlcN的褐變與pH值密切相關(guān)，美拉德反應(yīng)發(fā)生在pH值為4～9，隨著pH值上升，褐變加劇[25]。CmCBDA的最適pH值為9.0[24]，相比于CmCBDA，在CqCBDA的最適反應(yīng)pH值條件下，GlcN的非酶褐變減緩。

將酶液稀釋于不同pH值的緩沖液中，在40 ℃條件下孵育60 min，測定其殘余酶活力。重組CqCBDA的酸堿穩(wěn)定性測定結(jié)果如圖7(b)，圖7(b)顯示：在較廣的pH值范圍內(nèi)(pH值為6.0～10.0)，CqCBDA能保持良好的酸堿穩(wěn)定性，殘余酶活力均維持在70%以上；尤其是當(dāng)pH值在7.5～8.5時，其殘余酶活力仍能維持在90%以上，說明CqCBDA在弱堿性條件下穩(wěn)定性高。

圖6 溫度對重組CqCBDA酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on purified recombinant CqCBDA

圖7 pH值對重組CqCBDA酶活力的影響Fig.7 Effects of pH on purified recombinant CqCBDA

2.4.4動力學(xué)參數(shù)測定結(jié)果

在40 ℃、pH值為7.6的最適反應(yīng)條件下，以不同濃度的GlcNAc溶液作為底物，分別測定重組CqCBDA的比酶活力，通過Sigma plot軟件計算其動力學(xué)常數(shù)，動力學(xué)擬合曲線如圖8。CqCBDA的Vmax和Km分別為11.69 U·mg-1和3.90 mmol·L-1，計算可得Kcat和Kcat/Km分別為6.43 s-1和1.64 (s·mmol·L-1)-1。CmCBDA的Km值為(48±18)mmol·L-1[25]，相比于CmCBDA，CqCBDA與底物GlcNAc的親和力更高，更有利于酶催化反應(yīng)的進行。

圖8 重組CqCBDA的酶促反應(yīng)動力學(xué)方程擬合曲線Fig.8 Enzymatic reaction kinetic equation fitting curve of recombinant CqCBDA

2.4.5金屬離子對重組CqCBDA酶活力的影響

金屬離子通常作為輔因子參與到生物催化反應(yīng)過程，或者參與到酶高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化中，因而金屬離子對酶活力影響的考察對于指導(dǎo)生物催化劑的制備和穩(wěn)定化具有重要的意義。不同的金屬離子對于重組CqCBDA酶活力的影響，實驗結(jié)果如表1。表1顯示：Co2+、Cu2+、Zn2+對酶活力有顯著的抑制作用，其他金屬離子影響較小，EDTA對CqCBDA的酶活力影響也不大。結(jié)果表明：CqCBDA不是金屬依賴型酶，也不嚴(yán)格依賴某種金屬離子。

表1 金屬離子和EDTA對重組CqCBDA酶活力的影響Tab.1 Effects of metal ions and EDTA on activity ofrecombinant CqCBDA

3 結(jié) 論

GlcN具有多種生理活性，N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶作為酶法綠色制備GlcN中具有重要意義的水解酶，受到廣泛關(guān)注。本研究篩選得到了具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的卡西氏菌Cyclobacteriumqasimii來源的脫乙酰酶(CqCBDA)，并通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹和序列相似性比對分析，推斷其應(yīng)歸屬于Ydjc家族。利用基因工程的手段將CqCBDA在E.coliBL21(DE3)中進行異源表達(dá)，成功得到可溶性重組CqCBDA。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：CqCBDA的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH值為7.6，能在溫和條件下選擇性催化GlcNAc生產(chǎn)GlcN，可減少反應(yīng)過程中GlcN因褐變而導(dǎo)致的損失；在溫度低于40 ℃的條件下，CqCBDA能保持90%以上的相對酶活力，具有良好的穩(wěn)定性，金屬離子對其酶活性的影響較小。CqCBDA具有酶法生產(chǎn)制備GlcN的應(yīng)用潛力，希望能為GlcN的酶法制備提供理論依據(jù)。