曹澤虹，董玉瑋，李 超,張廣亮

(徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院/江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省食品與生物工程實(shí)驗(yàn)中心， 江蘇 徐州 221008)

和田駿棗(ZiziphusjujubaMill. cv Junzao)又叫和田玉棗，是中國新疆地理標(biāo)志產(chǎn)品，也是無公害綠色產(chǎn)品[1]。由于和田地處新疆南部，干旱少雨，光照時(shí)間長，晝夜溫差大，因此和田駿棗的質(zhì)量明顯高于其他棗類，富含多糖、維生素、微量元素及黃酮類等生物活性物質(zhì)。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅棗多糖具有提高免疫力和抗氧化的生理功能，可以補(bǔ)氣養(yǎng)血、預(yù)防心血管疾病，還有抗補(bǔ)體活性、抗腫瘤活性和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用[2-4]。

采用水溶提取法提取紅棗多糖[5]，具有無需大型設(shè)備、操作簡單安全性好、成本低、提取率高等優(yōu)勢，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[6]。由于提取工藝的限制，在紅棗多糖中往往會(huì)摻有一些蛋白質(zhì)，影響其品質(zhì)[7-8]，對紅棗多糖中蛋白質(zhì)進(jìn)行脫除，可以提高紅棗多糖的純度和品質(zhì)。

本研究以和田駿棗為研究材料，探究利用水提法提取紅棗多糖的工藝流程，以及紅棗多糖的蛋白脫除方法，以期為紅棗多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

和田駿棗(ZiziphusJujubaMill. cv Junzao)，購買于徐州市大潤發(fā)超市。

G- 250蛋白試劑，中國惠興生化試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)，天津市益力化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7230G型可見分光光度計(jì)、FA2104N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PC- 1000型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋、GZX- DH- 600型電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；L550型低速離心機(jī)，常州國華電器有限公司；FAD- 100A型組織粉碎機(jī)，華東冶礦機(jī)械廠；BCD- 13OH TB型海爾冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 紅棗的預(yù)處理

研究所用紅棗的預(yù)處理方法見圖1。

圖1 紅棗的預(yù)處理流程

1.4 多糖的提取實(shí)驗(yàn)

1.4.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取5份紅棗粉，每份1 g，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)[9-12]。選取提取時(shí)間2 h、提取溫度60 ℃的條件下進(jìn)行料液比實(shí)驗(yàn)研究，料液比(m(紅棗粉)∶V(水))選取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL；選取提取溫度60 ℃、料液比1∶25 g/mL的條件下進(jìn)行提取時(shí)間實(shí)驗(yàn)研究，提取時(shí)間選取2、3、4、5、6 h；選取提取時(shí)間2 h、料液比1∶25 g/mL的條件下進(jìn)行提取溫度實(shí)驗(yàn)研究，提取溫度選取 60、70、80、90、100 ℃，研究各因素對紅棗多糖提取率的影響。

1.4.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采取Box- Behnken設(shè)計(jì)方法，對料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以提取率為響應(yīng)值，通過實(shí)驗(yàn)得到數(shù)據(jù)并對其進(jìn)行分析，利用響應(yīng)面法來優(yōu)化提取工藝條件，由此可得到影響因素與響應(yīng)值之間的擬合方程，生成響應(yīng)面圖[13-14]，并利用軟件預(yù)測較佳工藝條件。

1.4.3多糖的提取

取稱1 g紅棗粉，按照較佳提取工藝進(jìn)行提取，提取后離心，得到上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，在60 ℃的條件下蒸發(fā)20 min，得到濃縮液，緩慢加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇溶液，放入4 ℃冰箱中冷藏12 h。將醇沉過夜的樣品在5 000 r/min條件下離心25 min，離心后將上清液倒出，取出沉淀物，在-50 ℃、10 Pa的條件下，冷凍干燥24 h，稱量得到一定質(zhì)量的紅棗多糖，計(jì)算粗多糖得率。

1.5 多糖蛋白的脫除實(shí)驗(yàn)

1.5.1多糖蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G- 250法測定蛋白質(zhì)的含量[7-8]。將紅棗多糖溶解于100 mL純水中，向試管中加入1 mL紅棗多糖溶液、5 mL G- 250蛋白試劑，振蕩均勻；2 min后，在595 nm波長處測吸光度，紅棗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/g)的計(jì)算見式(1)。

(1)

式(1)中，C為由樣品測定的吸光度代入回歸方程得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品提取液的總體積，mL；P為稀釋倍數(shù)；10-3為將μg換算成mg的轉(zhuǎn)換系數(shù)；W為稱取的紅棗粉質(zhì)量，g。

1.5.2多糖蛋白脫除率的測定

蛋白質(zhì)脫除率的計(jì)算見式(2)。

(2)

式(2)中，A0表示脫蛋白前樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；A1表示脫蛋白質(zhì)后樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g。

1.5.3多糖損失率的測定

紅棗多糖損失率的計(jì)算見式(3)。

(3)

式(3)中，B0表示脫蛋白前樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/g；B1表示脫蛋白后樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/g。

1.5.4多糖蛋白的脫除

1.5.4.1 Seveage法脫除

以m(紅棗多糖提取液)∶m(正丁醇與氯仿的混合液)=5∶1的比例，在紅棗多糖提取液中加入正丁醇與氯仿的混合液[V(正丁醇)∶V(氯仿)=1∶4]，混合均勻，用搖床震搖20 min，倒入分液漏斗中，靜置30 min，分液。重復(fù)進(jìn)行3次，分別測定紅棗多糖提取液中和脫蛋白的紅棗多糖提取液中的蛋白質(zhì)含量[7-8]，進(jìn)行蛋白質(zhì)的脫除率和紅棗多糖的損失率計(jì)算。

1.5.4.2 三氯乙酸法脫除

以m(紅棗多糖提取液)∶m(三氯乙酸)=1∶1.5的比例，在紅棗多糖提取液中加入體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)水溶液，混合均勻，在冰箱中靜置4～6 h，在離心速度為4 000 r/min條件下離心15 min，除去沉淀，保留上清液，重復(fù)2～3次，進(jìn)行蛋白質(zhì)的脫除率和紅棗多糖損失率的計(jì)算。

1.5.4.3 CaCl2法脫除

在紅棗多糖提取液中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為8，并加熱到85 ℃。將CaCl2加入提取液中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，加熱攪拌30 min，待溶液冷卻至室溫后過濾，濾液用2 mol/L稀HCl調(diào)整pH值至7。將濾液離心后收集上清液，重復(fù)2～3次，進(jìn)行蛋白質(zhì)的脫除率和紅棗多糖的損失率計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于大試管中，加入質(zhì)量濃度為6%的苯酚溶液1 mL和硫酸5.0 mL，靜置5 min，于100 ℃的水浴鍋中水浴15 min，適當(dāng)冷卻，然后在490 nm波長處測其吸光度。以葡萄糖含量質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C=15.245A+0.0147(R2=0.999 0)。

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

分別吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，再分別吸取蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2及0.0 mL于試管中，最后在每個(gè)試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G- 250，混勻。按照1.5.1節(jié)方法建立蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，其吸光度為縱坐標(biāo)，建立的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=15.245x+0.014 7(R2=0.990 3)。

2.3 多糖提取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

圖2 料液比對紅棗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of jujube polysaccharide

2.3.1.1 料液比的影響

按1.4.1節(jié)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，料液比對紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著料液比的降低，紅棗多糖在水溶液中的溶解度增加；但是當(dāng)料液比達(dá)到1∶30 g/mL以后，紅棗多糖的提取率又呈現(xiàn)出下降的趨勢，這是由于溶劑和溶質(zhì)之間的濃度差太大，反而會(huì)降低紅棗多糖在水中的溶解度，使紅棗多糖的提取率降低。因此當(dāng)料液比為1∶30 g/mL時(shí)，紅棗多糖的提取率最高，為40.07%。

2.3.1.2 提取時(shí)間的影響

按1.4.1節(jié)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，提取時(shí)間對紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對紅棗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of jujube polysaccharide

由圖3可知，提取時(shí)間越長，多糖提取越充分。但是，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3 h后，則多糖結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，因此導(dǎo)致多糖提取率下降。當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，紅棗多糖的提取率最高，為45.27%。

2.3.1.3 提取溫度的影響

按1.4.1節(jié)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，提取溫度對紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對紅棗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of jujube polysaccharide

由圖4可知，紅棗多糖的提取率最初隨著溫度的升高而增加。這是因?yàn)殡S著水浴溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，因此多糖的提取率也增加。當(dāng)溫度達(dá)到85 ℃以上時(shí)，紅棗多糖的提取率降低，因?yàn)檫^高的溫度會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)。當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，紅棗多糖的提取率最高，為45.53%。

2.3.2響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過單因素實(shí)驗(yàn)，得到水提法提取紅棗多糖較佳單因素條件為料液比為1∶30 g/mL，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為3 h。根據(jù)此條件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定提取紅棗多糖的最佳工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1。

表1 多糖提取條件響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab.1 Response surface experimental design and resultsof extraction conditions of ploysaccharides

利用Design expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到提取率對以上三個(gè)因素的擬合回歸方程為多糖提取率=45.23+1.43×A+0.53×B-0.020×C+0.72×A×B+0.17×A×C-0.27×B×C-2.89×A2-1.31×B2-0.37×C2，對該模型進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果表明，回歸方程具有較高的擬合度和可信度，實(shí)驗(yàn)誤差較小，表明模型的相關(guān)性非常好?；貧w系數(shù)R2>0.9，自變量與響應(yīng)值之間存在線性關(guān)系，因此，回歸方程可以進(jìn)一步用來進(jìn)行最佳提取工藝條件的優(yōu)化，所以可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化。根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖5。利用Design Expert軟件對提取紅棗多糖的最佳工藝條件進(jìn)行預(yù)測，由圖5可知，紅棗多糖的較佳提取工藝條件是料液比為1∶30 g/mL，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3 h，提取率為45.96%。

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在響應(yīng)面試驗(yàn)得出的較優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，測得的紅棗多糖提取率平均值為45.86%，與預(yù)測值基本相符。

2.4 紅棗多糖脫蛋白研究

2.4.1Seveage法脫除結(jié)果

用Seveage法進(jìn)行紅棗多糖的脫蛋白實(shí)驗(yàn)，脫蛋白前后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為5.91 mg/g和1.22 mg/g，蛋白質(zhì)的脫除率為79.36%；脫蛋白前后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.46 g/g和0.35 g/g，紅棗多糖的損失率為23.91%。

2.4.2三氯乙酸法脫除結(jié)果

用三氯乙酸法進(jìn)行紅棗多糖的脫蛋白實(shí)驗(yàn)，脫蛋白前后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為5.91 mg/g和1.06 mg/g，蛋白質(zhì)的脫除率為82.06%；脫蛋白前后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.46 g/g和0.39 g/g，紅棗多糖的損失率為15.21%。

2.4.3CaCl2法脫除結(jié)果

用CaCl2法進(jìn)行紅棗多糖的脫蛋白實(shí)驗(yàn)，脫蛋白前后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為5.91 mg/g和1.15 mg/g，蛋白質(zhì)的脫除率為80.54%；脫蛋白前后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.46 g/g和0.37 g/g，紅棗多糖的損失率為19.56%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3種多糖脫除蛋白的方法中，三氯乙酸法的蛋白脫除率最高，為82.06%，紅棗多糖的損失率也是最低的，為15.21%。

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)對水提法提取紅棗多糖的工藝條件進(jìn)行了研究，得到的較佳提取條件是料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間3 h、提取溫度80 ℃。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面對紅棗多糖提取工藝條件進(jìn)行研究，建立了提取率和各個(gè)因素之間的數(shù)學(xué)模型，得到了紅棗多糖提取的最佳工藝參數(shù)為m(紅棗)∶V(水)=1∶30 g/mL、提取時(shí)間3 h、提取溫度80 ℃，在此提取條件下，紅棗多糖的提取率為45.86%。

圖5 多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimum results of polysaccharide extraction by response surface methodology

采用Seveage法、三氯乙酸法和CaCl2法3種方法對紅棗多糖進(jìn)行了脫蛋白對比研究，結(jié)果表明，采用三氯乙酸法對紅棗多糖中蛋白質(zhì)的脫除效果最好、多糖損失率最低，多糖蛋白的脫除率為82.08%，多糖損失率為15.21%。