林澤帆 高分飛

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

大量證據(jù)表明吸煙與多種疾病有關(guān)，包括惡性腫瘤、心肺疾病和腦血管意外等[1-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，吸煙導(dǎo)致全球每年大約6萬人死亡，預(yù)計(jì)死亡人數(shù)將在2030年增加到800萬[4]。為了解煙草相關(guān)疾病的病理生理學(xué)機(jī)制，并闡明煙草煙霧引起疾病的機(jī)制，全世界在過去的幾十年中進(jìn)行了廣泛的研究。

在心血管疾病日益成為健康重要?dú)⑹值慕裉欤鼰熍c心血管疾病的關(guān)系也成為了研究的重要課題之一。在一項(xiàng)研究吸煙與外周動(dòng)脈疾病的薈萃分析中，與吸煙相關(guān)的外周動(dòng)脈疾病的RR值為2.71（95%CI：2.28-3.21，P<0.001）[5]。研究發(fā)現(xiàn)吸煙顯著增加了急性冠狀動(dòng)脈和腦血管疾?。òㄐ募」Ｈ?、中風(fēng)和猝死）的風(fēng)險(xiǎn)。另外也有研究表明吸煙會(huì)加速冠狀動(dòng)脈、主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和腦動(dòng)脈以及外周循環(huán)中產(chǎn)生早期動(dòng)脈粥樣硬化[6]。

傳統(tǒng)香煙煙霧包含的成分達(dá)到7,000種以上，其中尼古丁是主要成分[7]。在美國一項(xiàng)國家肺部篩查試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與非尼古丁依賴性吸煙者相比，尼古丁依賴性吸煙者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的OR值為0.24（95%CI 為0.08至0.69），說明尼古丁依賴是引起動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。煙草中的尼古丁進(jìn)入人體后通過作用于煙堿乙酰膽堿受體（Neuronal nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)而發(fā)揮作用。相關(guān)研究表明，nAChRs在心血管系統(tǒng)幾乎所有細(xì)胞（包括內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等）中普遍表達(dá)，且非神經(jīng)元nAChRs（如血管nAChRs）與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的nAChRs結(jié)構(gòu)極為相似[9-12]。盡管已有研究探討了吸煙與動(dòng)脈粥樣硬化之間的聯(lián)系，但尼古丁促動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制在很大程度上仍是推測(cè)性的。本文將就近年來有關(guān)尼古丁誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的研究進(jìn)展做一綜述。

1 動(dòng)脈粥樣硬化成因

動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見的血管慢性疾病，其會(huì)導(dǎo)致位于大中型動(dòng)脈的內(nèi)膜出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣斑塊等局灶性病變。低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein，LDL）在內(nèi)皮下滯留及其氧化修飾是動(dòng)脈粥樣硬化的最初原因，氧化的低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）通過誘導(dǎo)介導(dǎo)白細(xì)胞（單核細(xì)胞和T細(xì)胞）滾動(dòng)和粘附的幾種細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)來激活內(nèi)皮細(xì)胞。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞被激活時(shí)，其會(huì)表達(dá)P-選擇素（P-selectin）、血管粘附分子1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、細(xì)胞間粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、E-選擇素（E-selectin）和其他炎癥因子，吸引眾多淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合并滲入動(dòng)脈壁中[13]，其中單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，并吞噬Ox-LDL形成泡沫細(xì)胞（早期脂肪條紋病變的標(biāo)志）。激活的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可分泌多種化學(xué)因子和生長因子作用于相鄰的平滑肌細(xì)胞，誘導(dǎo)其在內(nèi)膜中增殖并合成細(xì)胞外基質(zhì)，從而產(chǎn)生纖維斑塊[14]。在晚期動(dòng)脈粥樣硬化中，大量巨噬細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞因子滲入血管壁中，巨噬細(xì)胞可通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）降解斑塊中的膠原纖維并導(dǎo)致斑塊破裂、出血和血栓形成[13]。

2 尼古丁對(duì)細(xì)胞功能的影響

2.1 尼古丁與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙

血管內(nèi)皮細(xì)胞是各種生理刺激的重要整合者和轉(zhuǎn)化者，積極參與血管收縮-舒張、凝血-抗凝血等生理過程。由于內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，內(nèi)皮損傷引起的內(nèi)皮功能障礙通常是血管疾病發(fā)展的最早事件。大中動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的局部和全身表現(xiàn)的重要因素。

完整的內(nèi)皮屏障取決于細(xì)胞骨架的收縮和內(nèi)皮細(xì)胞間連接的完整性，這兩者都可能受到尼古丁的影響。內(nèi)皮細(xì)胞屏障受肌動(dòng)蛋白/肌球蛋白細(xì)胞骨架的嚴(yán)格調(diào)控，骨架的收縮由肌球蛋白輕鏈激酶（Myosin light chain kinase，MLCK）和Rho激酶（Rho kinase enzymatic activities）活性共同控制[15]。研究表明，尼古丁可以作為傳統(tǒng)香煙煙霧或電子煙煙霧的一部分在循環(huán)系統(tǒng)中吸收，并通過氧化應(yīng)激激活P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK），進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)酰胺釋放引起內(nèi)皮屏障功能障礙，這是Rho激酶激活和細(xì)胞收縮的上游通路[16]。進(jìn)一步研究表明尼古丁主要通過內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶依賴性磷酸化作用抑制肌球蛋白磷酸酶1亞基（Myosin phosphatase target subunit 1，MYPT1），從而促進(jìn)肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）磷酸化，增加肌動(dòng)球蛋白的收縮信號(hào)達(dá)到破壞內(nèi)皮屏障的作用[17]。而內(nèi)皮間連接是由許多連接蛋白構(gòu)成，包括緊密連接蛋白ZO-1/2（ Zonula occludens-1/ zonula occludens-2 ，ZO-1/2）。連接蛋白表達(dá)下降可能導(dǎo)致內(nèi)皮間連接完整性的下降，因此被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能障礙和內(nèi)皮通透性過高的標(biāo)志性事件[18，19]。共聚焦顯微鏡分析表明，服用尼古丁的小鼠可出現(xiàn)內(nèi)皮間緊密連接破壞，表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和ZO-2表達(dá)減少，而ZO-1/2減少可被Nlrp3炎性小體（ Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat pyrin domain containing 3，NLRP3）基因缺陷阻止，其具體機(jī)制是尼古丁誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞溶酶體的損傷和組織蛋白酶B的釋放，進(jìn)而促進(jìn)Nlrp3炎性小體的聚集和激活以及炎性小體依賴性釋放的介導(dǎo)炎癥的高遷移率族蛋白B1 (High-mobility group box 1 protein，HMGB1)的表達(dá)[20]。最近的研究表明，HMGB1可通過晚期糖基化終末產(chǎn)物（RAGE）受體激活MAPK信號(hào)通路引起MMP-2和MMP-9過表達(dá)以及緊密連接蛋白ZO-1和緊密連接蛋白-5的表達(dá)降低進(jìn)而增大內(nèi)皮通透性，這表明Nlrp3炎性小體-HMGB1信號(hào)軸的激活可能是吸煙相關(guān)血管并發(fā)癥早期發(fā)展的重要觸發(fā)機(jī)制[21，22]。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠長期口服尼古丁后主動(dòng)脈出現(xiàn)腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)增加而一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表達(dá)降低，且經(jīng)尼古丁干預(yù)的肥胖大鼠腹膜巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液可抑制內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)并增加內(nèi)皮細(xì)胞NADPH亞基gp91phox和p22phox的表達(dá)，這表明內(nèi)皮功能障礙、血管氧化應(yīng)激和血管炎癥與巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子有關(guān)。[23]另外，經(jīng)qRT-PCR和western blot檢測(cè)尼古丁可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子肽NF-κB p65表達(dá)水平和核移位明顯增加。以往的研究已表明核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路是炎癥的核心調(diào)控因子，其可以促進(jìn)IκB激酶β（Inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ）、核因子kappaB p65（NF-κB p65）和抑制性κB蛋白（Ikppa Bα，IkBα）的表達(dá)[24]。

2.2 尼古丁與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、遷移

作為血管的組成成分，VSMC在動(dòng)脈粥樣硬化形成中扮演重要角色。越來越多的證據(jù)表明，在局部微環(huán)境中，VSMC對(duì)損傷性刺激具有顯著的表型可塑性。[25]。隨著病變的發(fā)展，VSMC向內(nèi)膜的遷移和增殖有助于纖維帽的形成[26]。同時(shí)VSMC會(huì)通過自分泌或旁分泌的方式分泌促炎、促增殖細(xì)胞因子激活VSMC并將巨噬細(xì)胞募集到損傷部位[27]。最新研究還認(rèn)為VSMC可通過其細(xì)胞膜表面表達(dá)的脂蛋白受體攝取脂質(zhì)，形成肌源性泡沫細(xì)胞[28]。

2.2.1 VSMC表型轉(zhuǎn)化

在正常狀態(tài)下，VSMC增殖水平低，并具有低合成活性。然而，在發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化慢性炎癥時(shí)，VSMC可發(fā)生異常調(diào)節(jié)，導(dǎo)致斑塊區(qū)VSMC脫分化，VSMC可從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停窗l(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從而獲得再增殖能力，并在增殖的同時(shí)合成與分泌大量細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)[29]。

Yoshiyama等人研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)尼古丁處理的VSMC同工型肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平表現(xiàn)出相似趨勢(shì)。合成型VSMC標(biāo)志物（肌球蛋白II 10和β-肌動(dòng)蛋白）的蛋白質(zhì)水平增加，并且收縮型VSMC標(biāo)志物（肌球蛋白II 11和α-肌動(dòng)蛋白）表達(dá)沒有顯著變化[30]。而在Wang等人的研究中，經(jīng)過尼古丁處理36 h的VSMC中α-肌動(dòng)蛋白和平滑肌22α的mRNA水平降低約50%，而合成型VSMC標(biāo)志物骨橋蛋白的合成上調(diào)1.5倍[31]。另外在一項(xiàng)相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)尼古丁處理可將VSCM膠原蛋白的表達(dá)提高2.1倍，而膠原蛋白I是VSMC合成表型的功能標(biāo)記[32]。在一般情況下，細(xì)胞骨架蛋白數(shù)量是穩(wěn)定的，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白表達(dá)數(shù)量的變化說明VSMC的表型已從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)槟峁哦”┞逗蟮暮铣尚汀?/p>

Wang等人研究還發(fā)現(xiàn)尼古丁降低了VSMC自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-α與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β的比值，提高了P65蛋白的表達(dá)與GFP-LC3 puncta的形成，且這種變化是通過尼古丁/nAChRs/ROS/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)，由此可見尼古丁與VSMC的凋亡密切相關(guān)[29]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，3-甲基腺嘌呤（3-MA，一種可有效阻止自噬的PI3K抑制劑）處理可消除尼古丁誘導(dǎo)的VSMCα-肌動(dòng)蛋白、平滑肌22α和骨橋蛋白以及膠原蛋白I合成的增加，并抑制細(xì)胞遷移，由此可見VSMC凋亡在尼古丁誘導(dǎo)的VSMC表型轉(zhuǎn)化中起到了介導(dǎo)作用[31]。

2.2.2 VSMC遷移與增殖

尼古丁除了可以促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)化，還可以引起VSMC遷移與增殖。Zhu等人發(fā)現(xiàn)經(jīng)尼古丁處理的巨噬細(xì)胞胞漿miR-21-3p可被包裝成外泌體轉(zhuǎn)移到VSMC中，以劑量依賴性的方式抑制PTEN基因的表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN基因抑制有助于VSMC的遷移和擴(kuò)散[33]。同時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn)也表明尼古丁處理顯著提高了VSMC的遷移能力[6]。

Xu 等人研究揭示了尼古丁可以通過nAChRα1/STAT3/蛋白激酶 B（Protein Kinase B，PKB）/雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）信號(hào)通路促進(jìn)小鼠VSMC的遷移和增殖。尼古丁能夠直接作用于VSMC上的nAChRα1，增加VSMC細(xì)胞STAT3磷酸化及增強(qiáng)STAT3的核易位，引起更多的p-STAT3與PKB啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，上調(diào)MMP-1的表達(dá)[34]。MMP-1通過降解斑塊內(nèi)膠原蛋白促進(jìn)斑塊擴(kuò)張、破裂和出血，為動(dòng)脈粥樣硬化提供了條件[38]。因此，靶向nAChRα1/STAT3可能被認(rèn)為是減輕尼古丁引起的動(dòng)脈粥樣硬化病變的新治療策略。另外Ren等人在體外細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)尼古丁對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞的作用也可由α1-nAChR誘導(dǎo)的鈣蛋白酶-1（Calpain-1）/MMP-2 / MMP-9信號(hào)通路介導(dǎo)[35]。MMP-2和MMP-9可通過細(xì)胞基質(zhì)降解和細(xì)胞基質(zhì)相互作用的消除來促進(jìn)斑塊破裂并誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡[36]。

2.3 尼古丁與巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與遷移

巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化病變中最豐富的免疫細(xì)胞類型，在疾病的所有階段（從病變開始到斑塊破裂）都具有重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，巨噬細(xì)胞積極參與脂蛋白的攝入和積累，從而形成充滿脂滴的泡沫細(xì)胞。逐漸積聚的泡沫細(xì)胞通過凋亡在內(nèi)膜中死亡，如果不及時(shí)處置，其會(huì)壞死并逐漸形成壞死和導(dǎo)致血栓形成[37]。另外巨噬細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子進(jìn)一步加劇了病變發(fā)炎，其蛋白水解活性促進(jìn)了斑塊的失穩(wěn)和破裂，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)的缺血事件，例如心肌梗塞或中風(fēng)[38]。巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮的關(guān)鍵作用使它們成為治療心血管疾病發(fā)展的重要靶標(biāo)。

Ming-Sheng等人研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可以增加人外周血CD36+/CD14+單核細(xì)胞的比例，且通過激活nAchR/ROS /蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）信號(hào)通路增加了人單核-巨噬細(xì)胞CD36的表達(dá)[39]。CD36是一種跨膜糖蛋白受體，可結(jié)合并內(nèi)化動(dòng)脈壁中的ox-LDL，促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[40]。

在一項(xiàng)體外研究中，Ren等人發(fā)現(xiàn)尼古丁對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的作用可由α1nAChR誘導(dǎo)的calpain-1/MMP-2 / MMP-9信號(hào)通路介導(dǎo)，并對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖和遷徙起促進(jìn)作用[41]。過往研究認(rèn)為，MMPs通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)VSMC向動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域遷移，并在該處增殖并增加病變的大小。此外由于在易損動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢測(cè)到MMPs水平升高，因此認(rèn)為MMPs可能會(huì)降低纖維帽的強(qiáng)度并導(dǎo)致斑塊破裂[42]。另外也有研究表明，nAChRα1 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)尼古丁誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p-STAT3，p-Akt和p-mTOR活化，而巨噬細(xì)胞經(jīng)mTOR特異性抑制劑雷帕霉素處理后MMP-2表達(dá)明顯下降，揭示了尼古丁通過nAChRα1/STAT3/Akt/mTOR/MMP-2信號(hào)通路加速動(dòng)脈粥樣硬化的可能性[43]。除了α1nAChR，近年來研究發(fā)現(xiàn)α7nAChR同樣是尼古丁作用于巨噬細(xì)胞的重要受體。Liu等人發(fā)現(xiàn)尼古丁通過激活巨噬細(xì)胞中的ERK1/2/c-Jun途徑誘導(dǎo)MMP-9，MMP-2，MCP-1和RANTES 上調(diào)， 且經(jīng)α7nAChR 激動(dòng)劑PNU-282987處理后上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及因子的表達(dá)收到抑制[44]。在一個(gè)類似的實(shí)驗(yàn)中，Li等人發(fā)現(xiàn)尼古丁促進(jìn)了巨噬細(xì)胞MMP-2、MMP-9 和VCAM-1 的表達(dá)， 且經(jīng)α7nAChR 激動(dòng)劑PNU-282987處理后顯著抑制了巨噬細(xì)胞ERK1/2和c-Jun的磷酸化[45]。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)皆表明尼古丁對(duì)巨噬細(xì)胞的作用可能是通過α7nAChR/ERK1/2/AP-1（c-Jun）通路實(shí)現(xiàn)對(duì)下游因子表達(dá)的控制，未來對(duì)此類信號(hào)通路的進(jìn)一步闡明將可能為動(dòng)脈粥樣硬化提供新治療策略的新型分子靶標(biāo)。

3 結(jié)語

尼古丁作為煙草的主要成分，在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的多條相關(guān)通路中扮演著重要角色，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成起著至關(guān)重要的作用。

尼古丁還涉及其他重要細(xì)胞，例如最近研究發(fā)現(xiàn)尼古丁會(huì)抑制與樹突狀細(xì)胞成熟和T細(xì)胞遷移相關(guān)的信號(hào)分子的表達(dá)[46]。對(duì)尼古丁致動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的深入探究有利于尋找心血管疾病的藥物治療靶點(diǎn)及藥物療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，為心血管藥物的開發(fā)提供新思路。