宋思源，溫芳，黃雯潔，陳曉雪，阮帥，顧蘇平，顧培杏，周佳鈺，李燁，劉佳彤，舒鵬

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南京 210029；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)；3 江蘇省中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

GC 患者的5 年生存率僅為20%～30%［1］。因此，尋找影響GC 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因和生物標(biāo)志物對(duì)于GC 的早期診斷、早治療、預(yù)后均具有重要意義。基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA 甲基化與癌基因、抑癌基因的沉默有關(guān)，可能與許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［2］。盡管一些研究［3］已證實(shí)，某些基因在GC 組織中存在異常的DNA 高甲基化或低甲基化，但其相互作用網(wǎng)絡(luò)的全面概況和途徑仍不明確。GC 患者中差異表達(dá)基因（Differentially expressed gene，DEG）和差異表達(dá)甲基化基因（Differentially Methylated gene，DMG）。但以往這些研究均沒有對(duì)獲得的DMG 基因進(jìn)行綜合分析，對(duì)GC 發(fā)病的核心基因相關(guān)研究較少。因此，2021年1月起，我們運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選GC 發(fā)病的核心基因，并分析其生物學(xué)功能?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 在GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索關(guān)鍵字“GC”來獲取GC基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE118916和甲基化數(shù)據(jù)集GSE25869。GSE118916（平臺(tái)：GPL15207 Affymetrix人類基因表達(dá)陣列）包括30例樣本，其中GC患者15例，正常成人15例。GSE25869（平臺(tái)GPL8490 Illumina HumanMethylation27 BeadChip）中納入72 例樣本，其中GC 患者24 例、正常成人48 例。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 GC患者癌組織及健康成人胃組織中表達(dá)上調(diào)的低甲基化基因（high-regulated hypomethylated genes，Hypo-HGs）、表達(dá)上調(diào)的低甲基化（致）癌基因、表達(dá)下調(diào)的高甲基化基因（low-regulated hypermethylated genes，Hyper-LGs）及表達(dá)下調(diào)的高甲基化抑癌基因篩選 使用R 軟件limma 數(shù)據(jù)包處理GSE118916、GSE25869數(shù)據(jù)集，以FDR ＜0.05 和|logFC|＞1 作為篩選DEG 的納入標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)DR ＜0.05 和|logFC|＞0.1 作為篩選DMG 的納入標(biāo)準(zhǔn)。從癌基因數(shù)據(jù)庫（http：//ongene.bioinfo-minzhao.org/）和腫瘤抑制基因數(shù)據(jù)庫（https：//bioinfo.uth.edu/TSGene/index.html）中生成GC的癌基因和抑癌基因，共獲得803個(gè)GC的癌基因、91個(gè)GC的抑癌基因。通過在線Venn 圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），將低甲基化DMG 基因、上調(diào)DMG 基因和GC的癌基因進(jìn)行重疊，得到Hypo-HGs、表達(dá)上調(diào)的低甲基化（致）癌基因。將高甲基化DMG基因、下調(diào)DMG基因和GC的抑癌基因進(jìn)行重疊，得到Hyper-LGs 和表達(dá)下調(diào)的高甲基化抑癌基因（down-regulated hypermethylated tumor suppressor genes，TSG）。

1.3 GC 患者癌組織Hypo-HGs、Hyper-LGs 生物學(xué)功能及相互作用的主要基因篩選

1.3.1 GC 患者癌組織Hypo-HGs、Hyper-LGs 生物學(xué)功能分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)Hypo-HGs、Hyper-LGs進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，分析DMG 的分子機(jī)制及生物學(xué)功能。GO 富集分析主要由生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cell components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）組成。

1.3.2 GC 患者癌組織Hypo-HGs、Hyper-LGs 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的主要基因篩查 將“1.2”中獲得的Hypo-HGs、Hyper-LGs 導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）中，進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，使用Cytoscape 進(jìn)行可視化，構(gòu)建Hypo-HGs、Hyper-LGs 的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，分析相互作用的主要基因。

1.4 GC的發(fā)病的核心基因篩選及驗(yàn)證

1.4.1 GC 發(fā)病的核心基因的篩選 ①集TCGASTAD 資料庫中胃腺癌患者癌組織中Degree 值排名前十的Hypo-HGs、Hyper-LGs、低甲基化癌基因及TSG 的表達(dá)情況，利用GEPIA 的在線工具（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html 繪制患者的Kaplan-Meier 生存曲線（OS），分析發(fā)病的核心基因不同表達(dá)的GC 患者的預(yù)后情況。Oncomine（https：//www.oncomine.org/）是基于微陣列的基因數(shù)據(jù)庫。使用Oncomine 數(shù)據(jù)庫對(duì)GC 癌組織中DMG 基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，最終得到GC發(fā)病的核心基因。

1.4.2 GC發(fā)病的核心基因的生物學(xué)功能分析 通過HPA 數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org/）收集GC患者和正常成人的臨床資料，比較癌組織及健康成人胃組織GC 發(fā)病的核心基因蛋白的表達(dá)情況。使用cBioPortal 工具（http：//www.cbioportal.org/）比較納入胃腺癌患者GC 發(fā)病的核心基因的突變情況。對(duì)發(fā)病的核心基因進(jìn)行GO、KEGG 富集分析，分析其生物學(xué)功能。

2 結(jié)果

2.1 GC 患者癌組織Hypo-HGs、表達(dá)上調(diào)的低甲基化（致）癌基因、Hyper-LGs及TSG 由GSE118916表達(dá)矩陣得到，GC 組織及健康成人胃組織中存在1 163 個(gè)DEG，其中528 個(gè)上調(diào)DEG 基因、635 個(gè)下調(diào)DEG 基因。由GSE25869 中表達(dá)矩陣得到，GC 組織及健康成人胃組織中存在2 589個(gè)DMG，包括680個(gè)高甲基化DMG 基因、1 909 個(gè)低甲基化DMG 基因。GC 患者癌組織中有FN1、COL3A1 及COL1A1 等110個(gè)Hypo-HGs，其中TAC1、TWIST1、UCHL1、SPARC、GREM1、MEF2C、MAFB 等9 個(gè)基因?yàn)楸磉_(dá)上調(diào)的低甲基化（致）癌基因；有CDH1、FOXA1 及KLF4 等23個(gè)Hyper/LGs，其中AZGP1、CDH1為TSG。

2.2 GC 患者癌組織Hypo-HGs、Hyper-LGs 的生物學(xué)功能及相互作用的主要基因

2.2.1 GC 患者癌組織Hypo-HGs、Hyper-LGs 的生物學(xué)功能 Hypo-HGs 的BP 主要集中在細(xì)胞粘附和細(xì)胞外基質(zhì)組織中，CC 主要集中在細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間和細(xì)胞外體中，MF 主要集中在蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合和肝素結(jié)合。KEGG 分析結(jié)果表明，Hypo-HGs 的生物學(xué)功能主要集中在粘著斑、PI3KAkt信號(hào)傳導(dǎo)途徑和ECM-受體相互作用中。

Hyper-LGs的BP主要在尼古丁和異種生物代謝過程富集，CC 主要富集于質(zhì)膜，MF 主要富集于糖蛋白結(jié)合。KEGG 分析結(jié)果表明，Hyper-LGs 的生物學(xué)主要集中在藥物代謝一細(xì)胞色素P450、化學(xué)致癌作用和細(xì)胞色素P450異源生物的代謝中。

2.2.2 GC 患者癌組織Hypo-HGs、Hyper-LGs 的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的主要基因 按度值排序，F(xiàn)N1、COL3A1、COL1A1、COL1A2、MMP2 等Hypo-HGs，CDH1、FOXA1 及KLF4 等Hyper-LGs，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中處核心位置。

2.3 GC 發(fā)病的核心基因 GC 患者癌組織與健康成人組織Hyper-LGs、表達(dá)上調(diào)的低甲基化（致）癌基因、Hyper-LGs 及TSG 基因表達(dá)比較 健康成人胃部組織比較，GC組織中COL3A1、COL1A2、COL1A2、SPARC、CDH1 和TMEM45B 基因表達(dá)升高而PXMP2表達(dá)降低。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，癌組織高表達(dá)COL1A1、THBS1、COL5A2、COL12A1、CXCR4 的GC 患者的總生存期短（P均＜0.05）。GC 發(fā)病的核心基因?yàn)镃OL1A1、THBS1、COL5A2、COL12A1及CXCR4。

2.4 GC發(fā)病的核心基因生物學(xué)功能 正常成人胃組織中COL1A1 蛋白、COL12A1 蛋白低表達(dá)，HBS1蛋白高表達(dá)。GC 組織中COL1A1 蛋白低表達(dá)，THBS1 蛋白、COL12A1 蛋白不表達(dá)。cBioPortal 分析結(jié)果顯示，393 例胃腺癌患者中，有101 例（26%）患者存在COL1A1、THBS1、COL5A2、COL12A1 及CXCR4基因突變。

GC 發(fā)病的核心基因BP 主要包括膠原原纖維組織、膠原分解代謝過程。CC 主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞外基質(zhì)。MF 包括細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分。KEGG 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GC 發(fā)病的核心基因主要在ECM-受體相互作用、蛋白質(zhì)的消化吸收，粘著斑和PI3KAkt信號(hào)傳導(dǎo)途徑顯著富集。

3 討論

本研究中，我們使用生物信息學(xué)工具來分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE118916 和甲基化數(shù)據(jù)集GSE25869，最終篩選獲得110 個(gè)Hypo-HGs，其中9個(gè)為表達(dá)上調(diào)的低甲基化（致）癌基因。得到23 個(gè)Hyper-LGs 和2 個(gè)TSG。PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，Hypo-HGs 中的FN1、COL3A1、COL1A1、COL1A2、MMP2，Hyper-LGs 中的CDH1、FOXA1 和KLF4 在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。

進(jìn)一步GO 分析結(jié)果表明，Hypo-HGs 的生物學(xué)過程主要涉及細(xì)胞粘附和細(xì)胞外基質(zhì)組織。細(xì)胞粘附參與多種腫瘤細(xì)胞的病理和生理過程，細(xì)胞—細(xì)胞粘附和細(xì)胞-基質(zhì)粘附的變化可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［4］。細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）是粘附分子免疫球蛋白超家族（IGSF）的成員。當(dāng)人體發(fā)生炎癥或感染時(shí)，ICAM-1 可能被過度激活并表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的免疫反應(yīng)。研究［5］發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移率高的GC 細(xì)胞中可以檢測(cè)到ICAM-1 的高水平表達(dá)，這表明ICAM-1 的表達(dá)與GC 的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可有效用于GC血源性淋巴轉(zhuǎn)移的臨床監(jiān)測(cè)。

Hyper-LGs 的生物學(xué)過程主要涉及對(duì)尼古丁和異種生物代謝過程的反應(yīng)。尼古丁可以顯著上調(diào)MMP7 的表達(dá)，而MMP7 高表達(dá)在癌癥的侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用，吸煙成癮會(huì)增加發(fā)生GC 的風(fēng)險(xiǎn)［6］。外源性代謝過程可能會(huì)調(diào)節(jié)GC 的敏感性。KEGG 分析結(jié)果表明，Hypo-HGs 在粘著斑、PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑和ECM-受體相互作用中顯著富集。研究發(fā)現(xiàn)粘著斑參與了GC 的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，鈣釋放激活的鈣調(diào)節(jié)2（ORAI2）通過PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK依賴性粘著斑分解來促進(jìn)GC 的致瘤性和轉(zhuǎn)移［7］。PI3K-Akt 途徑廣泛分布于各種細(xì)胞中，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。PI3K-Ak 通路異?？赡苡|發(fā)癌癥的發(fā)生和發(fā)展［8］。ECM 是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分［9］。Hyper-LGs在藥物代謝—細(xì)胞色素P450，化學(xué)致癌作用和細(xì)胞色素P450 異源生物的代謝中顯著富集。細(xì)胞色素P450 家族基因通過細(xì)胞色素P450 的異源代謝參與了GC 的發(fā)展［10］。細(xì)胞色素P450家族2亞家族E多肽1（CYP2E1）的過表達(dá)促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制其凋亡。

GEPIA 數(shù)據(jù)庫在收集GC 組織中FN1、COL3A1、COL1A1、COL1A2、MMP2、FBN1、SPARC、THBS1、COL5A2、CDH1、FOXA1、KLF4、AZGP、GC、CYP2C9、MGST1、PXMP2、SLC16A、TMEM1、TWEM45B、MEF2C、MAFB、HHEX 和CXCR4 等28個(gè)基因的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，GC 組織中COL3A1、COL1A2、SPARC、CDH1、TMEM45B基因高表達(dá)，PXMP2 基因低表達(dá)。研究［11］發(fā)現(xiàn)，COL3A1 在膀胱癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過表達(dá)。COL1A2 與GC 的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。COL1A2 的高表達(dá)可能表明GC 患者的臨床預(yù)后較差［12］。SPARC 的高表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞的活性，并增強(qiáng)了上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成［13］。CDH1 的致病突變和種系缺失是早期彌漫性GC的重要致病因素［14］。TMEM45B 在許多類型的腫瘤中異常表達(dá)。抑制TMEM45B 可以抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路，從而抑制GC 細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲［15］。

生存分析表明，高表達(dá)COL1A1、THBS1、COL5A2、COL12A1、CXCR4 的GC 患者總生存期較短。Oncomine數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了5個(gè)發(fā)病的核心基因在GC 中的表達(dá)，結(jié)果表明COL1A1、THBS1、COL5A2、COL12A1 在GC 中表達(dá)。對(duì)5 種發(fā)病的核心基因的富集分析發(fā)現(xiàn)，BP 主要包括原纖維組織和膠原分解代謝過程。KEGG主要包括ECM-受體相互作用、蛋白質(zhì)的消化吸收、黏著斑和PI3K-Akt 信號(hào)通路。cBioPortal 顯示，26%的胃腺癌患者存在這五個(gè)基因的突變。

COL1A1、COL5A2、COL12A1 屬于膠原形成基因家族［16］，每個(gè)膠原由3 條以阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)的多肽鏈組成。膠原蛋白是GC 細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，也是微環(huán)境的主要成分。當(dāng)GC 發(fā)生時(shí)，膠原蛋白合成增加并誘導(dǎo)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。GC 組織中COL1A1 的表達(dá)高于正常組織，這與GC 患者的預(yù)后有關(guān)。COL5A2 與骨肉瘤、膀胱癌和GC 的病理過程有關(guān)。研究［17］發(fā)現(xiàn)，COL12A1 在結(jié)締組織疾病中異常表達(dá)，并且COL12A1 突變與患者的不良預(yù)后有關(guān)。COL12A1在GC 中高表達(dá)，這與不良的OS 和PFS 有關(guān)［18］。研究發(fā)現(xiàn)THBS1 突變與早期GC 有關(guān)。THBS1 可能通過影響腫瘤純度，TMB、TME 評(píng)分和多種致癌信號(hào)通路而成為GC的新預(yù)后指標(biāo)［19］。

綜上所述，GC 發(fā)病的核心基因主要有COL1A 1、THBS1、COL5A2、COL12A1、CXCR4，其生物學(xué)過程主要包括膠原原纖維組織、膠原分解代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分。GC 患者發(fā)病的核心基因主要通過ECM-受體相互作用、蛋白質(zhì)的消化吸收、粘著斑和PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。GC 發(fā)病的核心基因可作為精確診斷和治療GC的靶向標(biāo)志物。