羅梅娟，胡家奇，魏穎，歐巧群，翁志媛，王麗娜，張又祥

廣州市第一人民醫(yī)院華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院兒科，廣州510180

早產(chǎn)兒常伴隨宮內(nèi)感染、膿毒血癥、呼吸窘迫綜合征等并發(fā)癥。近年來(lái)隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的發(fā)展，早產(chǎn)兒尤其是極早產(chǎn)兒（胎齡＜32 周）的存活率明顯升高。但極早產(chǎn)兒因消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟、胃腸分泌能力低下、腸道菌群紊亂等因素，在出生后喂養(yǎng)過(guò)程中極易出現(xiàn)喂養(yǎng)不耐受（feeding intolerance，F(xiàn)I）。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)I 和腸道菌群存在緊密的關(guān)系，尤其早產(chǎn)兒早期喂養(yǎng)不耐受，與其腸道菌群定植延遲、種類缺乏，尤其是乳酸桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）缺乏有關(guān)。有別于傳統(tǒng)的DGGE法、熒光定量PCR法等檢測(cè)腸道菌群，高通量測(cè)序技術(shù)通過(guò)細(xì)菌16S rDNA 的不同特異區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，進(jìn)而獲得更多的高質(zhì)量的菌群基因組信息。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，腸道菌群在極早產(chǎn)兒中的作用漸漸被肯定，在極早產(chǎn)兒的免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、代謝等方面均發(fā)揮重要作用［1，2］。本研究采集FI 的極早產(chǎn)兒胎糞進(jìn)行高通量測(cè)序，分析其腸道菌群的特征?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月間廣州市第一人民醫(yī)院住院的早產(chǎn)兒24 例。極早產(chǎn)兒納入標(biāo)準(zhǔn)［3］：①胎齡＜32周；②胎盤病理診斷完整；③同意參加本研究。極早產(chǎn)兒排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在先天畸形或者染色體異常；②出生后因病情危重或其他因素放棄治療或死亡。FI 診斷標(biāo)準(zhǔn)：①喂養(yǎng)3 h后胃內(nèi)殘留量仍大于上次喂養(yǎng)量的50%，且每次喂養(yǎng)量均不小于下列各體質(zhì)量范圍的最低喂養(yǎng)量（體質(zhì)量＜500 g者2 mL、500～749 g 者3 mL、750～1 000 g者4 mL、＞1 000 g 者5 mL）；②嘔吐≥3 次/天；③胃殘液或嘔吐物為咖啡樣液體；④禁食＞2 次/天；⑤腹脹（腹圍24 h內(nèi)增加≥1.5 cm，有腸型）、胃內(nèi)殘留或嘔吐膽汁樣物、大便潛血陽(yáng)性均需同時(shí)合并其他FI 癥狀。符合上述情況之一明確診斷為FI［4-5］。24 例極早產(chǎn)兒中喂養(yǎng)耐受（feeding tolerance，F(xiàn)T）組8 例，其中男4 例、女4 例，出生周齡為（30.62±1.05）周，出生體質(zhì)量為（1 426.25±255.48）g；FI組16例，其中男9例、女7例，出生周齡（30.25±1.17）周，出生體質(zhì)量為（1 400.62±188.74）g。兩組性別、出生周齡和出生體質(zhì)量具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 兩組出生時(shí)胎糞中腸道菌群檢測(cè)及菌群豐度測(cè)算 兩組患兒出生24 h內(nèi)使用無(wú)菌糞便采集管收集患兒糞便，-80 ℃冰箱凍存，利用Qiagen 公司Stool DNA 提取試劑盒提取糞便DNA，DNA 提取完成后行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度和濃度，無(wú)降解、無(wú)RNA 污染、雜帶為合格樣本，合格DNA 用無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的DNA 為擴(kuò)增模板，引物為16SV4 區(qū)段515F-806R（F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' 806：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）反應(yīng)程序設(shè)置為：98 ℃預(yù)變性1 min；30 個(gè)循環(huán)（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min，使用New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 進(jìn)行擴(kuò)增，所得PCR 產(chǎn)物用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)質(zhì)量）；選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，進(jìn)行膠回收目標(biāo)條帶。產(chǎn)物純化使用Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒。

1.2.1 兩組腸道菌群chao 1 指數(shù)、shannon 指數(shù)測(cè)算 采用高通量測(cè)序法。使用New England Biolabs公司的NEB Next? Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 3.0 熒光定量?jī)x定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用HiSeq 2500系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè)序完成后原始數(shù)據(jù)拼接、過(guò)濾，以及基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，根據(jù)OTUs 聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTUs 的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

使用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計(jì)算chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)，chao1 指數(shù)［6］主要關(guān)心樣本的物種豐富程度，表示預(yù)測(cè)的OTUs 個(gè)數(shù)；Shannon 指數(shù)［7］綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度，故指數(shù)的高低還會(huì)受均勻度影響，樣本中的物種分布越均勻，多樣性越高。

1.2.2 兩組腸道菌群相對(duì)豐度測(cè)算 根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTUs 的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。采用RDP classifier Bayesian 模型［8］對(duì)OTU 進(jìn)行分析，基于SILVA［9］和Greengene［10］數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)樣本門、科、屬等水平的腸道細(xì)菌相對(duì)豐富，分析細(xì)菌的特征。菌群分析及測(cè)算由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供技術(shù)支持。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Adobe Illustrator CS5 和Graphpad Primer 7.0 軟件分析繪圖。計(jì)數(shù)資料用例表示，Shapiro-Wilk 法行正態(tài)性檢驗(yàn)和Bartlett 法行方差齊性檢驗(yàn)；計(jì)量資料以xˉ±s 或者M(jìn)（Q1，Q3）表示，滿足正態(tài)分布及方差齊性后兩組樣本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，不符合者采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析性別差異采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸道菌群chao 1 指數(shù)、shannon 指數(shù)比較FI 組、FT 組chao 1 指數(shù)分別為1 538.56 ± 545.72、1 052.50±106.86，P＜0.05。FI 組、FT 組shannon 指數(shù)分別為7.06±1.51、5.62±1.37，P＜0.05。

2.2 兩組腸道菌群相對(duì)豐度比較 FI 組、FT 組門水平上變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度分別為0.214 913（0.054 596，0.345 245）、0.585 904（0.068 144，0.688 192），厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度分別為0.424 363（0.305 997，0.545 460）、0.288 521（0.179 652，0.540 196），Cyanobacteria相對(duì)豐度分別為0.007 401（0.002 593，0.013 151）、0.001 944（0.000 947，0.004 179）、擬桿菌門（Bacteroidetes）相對(duì)豐度分別為0.189 504（0.067 325，0.339 956）、0.113 030（0.032 838，0.276 445），放線菌門（Actinobacteria）相對(duì)豐度分別為0.026 416（0.012 754，0.048 859）、0.015 837（0.010 629，0.030 209），、無(wú)壁菌門（Tenericutes）相對(duì)豐度分別為0.003 541（0.002 008，0.010 732）、0.002 320（0.000 447，0.004 332），Acidobacteria相對(duì)豐度分別為0.003 101（0.001 096，0.004 459）、0.000 617（0.000 422，0.001 203）、未分類菌門（unidentified_Bacteria）相對(duì)豐度為0.008 053（0.002 242，0.012 186）、0.002 874（0.001 103，0.006 407），Verrucomicrobia相對(duì)豐度分別為0.004 903（0.003 087，0.005 545）、0.001 270（0.000 631，0.003 051），Chloroflexi 相對(duì)豐度分別為0.001 547（0.000 404，0.002 278）、0.000 220（0.000 124，0.000 582），其他菌門（Others）相對(duì)豐度分別為0.014 432（0.009 767，0.021 013）、0.005 109（0.003 548，0.007 042）。與FT 組比較，F(xiàn)I 組Cyanobacteria、Acidobacteria、Verrucomicrobia、Chloroflexi、Others 相對(duì)豐度均增加（z 分別為-2.572，-2.267，-3.307，-2.664，-2.694；P＜0.05）。

FI 組、FT 組科水平上unidentified_Cyanobacteria相對(duì)豐度分別為0.007 103（0.002 483，0.010 664）、0.001 916（0.000 898，0.003 927），未分類的梭菌科（unidentified_Clostridiales）相對(duì)豐度分別為0.006 705（0.004 183，0.011 612）、0.005 080（0.002 476，0.008 582），消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）相對(duì)豐度分別為0.005 691（0.004 349，0.009 316）、0.004 491（0.002 934，0.006 677），毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對(duì)豐度分別為0.126 646（0.038 241，0.195 766）、0.047 901（0.020 900，0.106 516），瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相對(duì)豐度分 別 為0.077 908（0.022 794，0.126 142）、0.028 069（0.011 878，0.079 476），Others 相對(duì)豐度分別為0.514 787（0.367 003，0.610 660）、0.315 008（0.144 328，0.485 203），腸桿菌科（En-terobacteriaceae）相對(duì)豐度分別為0.023 791（0.014 400，0.074 555）、0.066 236（0.013 166，0.611 001），腸球菌科（Enterococcaceae）相對(duì)豐度分別為0.024 635（0.013 471，0.071 589）、0.048 433（0.012 868，0.092 918），鏈球菌科（Streptococcaceae）相對(duì)豐度分別為0.008 245（0.004 672，0.014 918）、0.025 614（0.003 200，0.055 497），伯克氏菌科（Burkholderiaceae）相對(duì)豐度分別為0.010 395（0.004 970，0.048 923）、0.004 009（0.002 75，0.141 288），鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）相對(duì)豐度分別為0.002 583（0.002 153，0.021 336）、0.002 114（0.001 249，0.122 215）。與FT 組比較，F(xiàn)I組unidentified_Cyanobacteria、Others 相對(duì)豐度均增加（Z分別為-2.572，-2.176；P＜0.05）。

FI組、FT組屬水平上，對(duì)相對(duì)豐度前100的菌屬進(jìn)行兩組間的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，篩選出7 種差異細(xì)菌。unidentified_Cyanobacteria相對(duì)豐度分別為0.007 103（0.002 597，0.009 856）、0.001 916（0.001 359，0.002 728），Pseudomonas相對(duì)豐度分別為0.001 384（0.000 614，0.003 441）、0.000 532（0.000 429，0.000 791），Catellicoccus相對(duì)豐度分別為0.000 156（0.000 039，0.000 341）、0.000 000（0.000 000，0.000 043），unidentified_Lachnospiraceae相對(duì)豐度分別為0.034 384（0.008 993，0.046 156）、0.012 013（0.006 059，0.021 563），Massilia相對(duì)豐度分別為0.000 319（0.000 124，0.000 983）、0.000 085（0.000 046，0.000 099），Cellulomonas相對(duì)豐度分別為0.000 057（0.000 014，0.000 170）、0.000 000（0.000 000，0.000 000），Oceanobacter相對(duì)豐度分別為0.000 000（0.000 000，0.000 004）、0.000 050（0.000 011，0.000 078）。與FT 組比較，F(xiàn)I 組腸道unidentified_Cyanobacteria、Pseudomonas、Catellicoccus、unidentified_Lachnospiraceae、Massilia和Cellulomonas相對(duì)豐度升高，Oceanobacter相對(duì)豐度降低（Z分別為-2.572，-2.205，-2.233，-2.347，-2.728，-2.770，-2.053；P均＜0.05）。

3 討論

健康人的腸道中有超過(guò)1014個(gè)的細(xì)菌數(shù)量，菌群種類在1 000種以上，腸道細(xì)菌數(shù)量和菌群種類保持一定的動(dòng)態(tài)平衡，有利于維持機(jī)體健康，同時(shí)腸道菌群也被譽(yù)為人類“隱形的器官”［11］。腸道菌群失衡會(huì)導(dǎo)致炎癥性腸病、代謝綜合征、神經(jīng)認(rèn)知發(fā)育異常等疾病。近年來(lái)提出的“重視生命階段早期的菌群特征”并在疾病早期進(jìn)行干預(yù)，也是腸道微生態(tài)研究的重要方向。

早產(chǎn)兒作為特殊的群體，受出生胎齡、出生體質(zhì)量、出生后喂養(yǎng)情況、抗生素應(yīng)用等多因素影響，存在菌群定植能力低下、腸道菌群屏障構(gòu)建遲滯、多樣性下降等問(wèn)題［12］。近年來(lái)隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房呼吸、營(yíng)養(yǎng)等支持條件的進(jìn)步，極早產(chǎn)兒的存活率顯著提高，但同時(shí)也漸漸顯露出許多臨床問(wèn)題，由于胎齡＜32 周早產(chǎn)兒平滑肌發(fā)育不成熟、胃腸道激素分泌和消化酶活性差等原因，出現(xiàn)FI 的極早產(chǎn)兒消化系統(tǒng)問(wèn)題則更為突出［4］，一旦出現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，可能會(huì)導(dǎo)致如壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生，甚至敗血癥、過(guò)敏性疾病以及代謝性疾病等其他腸外系統(tǒng)疾病的發(fā)生。極早產(chǎn)兒除胎齡因素外，F(xiàn)I 也一直是臨床醫(yī)生關(guān)注的方面，盡管腸道菌群與FI 的關(guān)系在國(guó)內(nèi)外的許多研究中得到肯定，但關(guān)于極早產(chǎn)兒群體的研究卻很少。為此，我們選取2018 年1 月—2019 年12月在廣州市第一人民醫(yī)院住院的早產(chǎn)兒為研究對(duì)象。根據(jù)極早產(chǎn)兒和FT/不耐受的標(biāo)準(zhǔn)入組，將極早產(chǎn)兒分為FT 組和FI組。為高效、快速、全面分FT極早產(chǎn)兒和FI極早產(chǎn)兒的菌群特征，本研究采取Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)，基于16S rDNA 的微生物群落分析原則，對(duì)極早產(chǎn)兒出生后24 h 內(nèi)胎糞中的微生物物種進(jìn)行分析，估算其微生物種的多樣性、豐度和物種構(gòu)成，進(jìn)而探索FI 極早產(chǎn)兒出生菌群的特征并獲得以下發(fā)現(xiàn)：FI極早產(chǎn)兒腸道菌群多樣性較FT極早產(chǎn)兒顯著升高，且Cyanobacteria門、Acidobacteria門、Verrucomicrobia門、Chloroflexi門、unidentified_Cyanobacteria科、unidentified_Cyanobacteria屬、Pseudomonas屬、Catellicoccus屬、unidentified_Lachnospiraceae屬、Massilia屬和Cellulomonas屬在FI 組中顯著富集，并且在門水平和科水平，非優(yōu)勢(shì)菌門/科（Others）在FI 組顯著增加，提示FI 極早產(chǎn)兒腸道菌群多樣性的增加可能與條件致病菌/非常駐菌的相對(duì)豐度顯著增加有關(guān)。

極早產(chǎn)兒出生胎齡小，腸道菌群未發(fā)育成熟，尤其是常駐的優(yōu)勢(shì)菌增殖能力不健全，并且剖腹產(chǎn)患兒，在相對(duì)無(wú)菌的出生條件中原駐菌豐度較經(jīng)陰道分娩低，伴隨出生存在的致病因素，條件致病菌豐度可能會(huì)增加。其中Cyanobacteria競(jìng)爭(zhēng)性抑制其他常駐菌能力強(qiáng)，在無(wú)氧條件下能較好生長(zhǎng)，并且破壞腸腔內(nèi)無(wú)氧/微氧條件，可能與極早產(chǎn)兒消化道癥狀有關(guān)。Cyanobacteria產(chǎn)生的β-甲基氨基-1-丙氨酸及其最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體2，4-二氨基丁酸和N-2-氨基乙基甘氨酸能夠引起腸神經(jīng)功能紊亂；Pseudomonas則是臨床中常見(jiàn)的新生兒宮內(nèi)感染病原菌［13］，可以介導(dǎo)早產(chǎn)兒肺炎、眼部感染、咽峽炎、甚至敗血癥等多種感染［14-16］；Massilia是與感染性角膜炎、中耳炎有關(guān)的條件致病菌［17-18］；Cellulomonas則是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的與敗血癥、感染性心內(nèi)膜炎、膽管炎發(fā)生相關(guān)的致病菌［19-20］；Lachnospiraceae是人類腸道菌群中富集菌科，與短鏈脂肪酸的產(chǎn)生有關(guān)，可以為腸上皮提供能量，同時(shí)影響Treg/Th17 比值，介導(dǎo)腸道免疫反應(yīng)［21-22］。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)了Catellicoccus和Oceanobacter兩種報(bào)導(dǎo)較少的海洋菌，人類疾病的研究極少，二者在早產(chǎn)兒FT情況中的研究仍需進(jìn)一步探索。

基于我們的研究，F(xiàn)I 極早產(chǎn)兒的腸道菌群特征有其特殊性，既往研究［23］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)I 早產(chǎn)兒在未發(fā)生FI 前菌群多樣性個(gè)體差異較大，但大多提示FI 早產(chǎn)兒的多樣性下降，本研究中發(fā)現(xiàn)極早產(chǎn)兒的多樣性反而增高，可能是由于FI 極早產(chǎn)兒腸道菌群中致病菌相對(duì)豐度增加所致。FI 早產(chǎn)兒致病菌增多［如肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）］而Lactobacillus、Bifidobacterium等益生菌減少，并且克雷伯氏菌屬（Klebsiella）與FI 癥狀顯著相關(guān)，同時(shí)較大胎齡的早產(chǎn)兒在益生菌豐度下降方面比致病菌增加更顯著［24-25］。而本研究納入的極早產(chǎn)兒較以往早產(chǎn)兒菌群研究中的納入對(duì)象出生胎齡小，表現(xiàn)為Cyanobacteria門、Lachnospiraceae科、Cellulomonas屬、Pseudomonas屬、Massilia屬等條件致病菌或者介導(dǎo)腸道免疫反應(yīng)的細(xì)菌顯著富集。由此可見(jiàn)，對(duì)于極早產(chǎn)兒臨床診療過(guò)程中，應(yīng)該更關(guān)注條件致病菌的增加問(wèn)題，極早產(chǎn)兒不同于較大胎齡的早產(chǎn)兒，其腸道菌群結(jié)構(gòu)更薄弱，對(duì)于致病菌的抵抗力更低，對(duì)于極早產(chǎn)兒而言，在早期（出生時(shí)）應(yīng)用抗生素和補(bǔ)充Lactobacillus、Bifidobacterium等益生菌更為迫切，因?yàn)镃yanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等細(xì)菌的繁殖能力強(qiáng)，對(duì)常駐菌的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用強(qiáng)烈，更容易介導(dǎo)腸道菌群紊亂。此外，對(duì)于極早產(chǎn)兒糞便菌群的檢測(cè)，關(guān)注Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等細(xì)菌的相對(duì)豐度，有利于預(yù)判FI的發(fā)生，及早進(jìn)行配方奶、益生菌等干預(yù)。

但本研究系小樣本的研究，存在一定偏倚，且采集樣本的節(jié)點(diǎn)只有出生24 h 以內(nèi)一個(gè)，無(wú)法動(dòng)態(tài)分析極早產(chǎn)兒腸道菌群的變化及其與FT程度的關(guān)系。在后續(xù)的研究中完善大樣本的臨床數(shù)據(jù)調(diào)查和樣本分析，增加多個(gè)采集樣本的節(jié)點(diǎn)，深入致病菌的具體作用分子機(jī)制仍需不斷探索。

綜上所述，F(xiàn)I 的極早產(chǎn)兒出生時(shí)腸道菌群的多樣性下降，Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等菌群富集明顯。Cyanobacteria、Cellu-lomonas、Pseudomonas、Massilia等條件致病菌的菌群變化可能是極早產(chǎn)兒出現(xiàn)FI 的原因。在臨床工作中需關(guān)注極早產(chǎn)兒腸道菌群建立的因素，特別是條件致病菌的影響，并且采取有效措施及早建立正常的腸道菌群，減少FI 的發(fā)生，同時(shí)及早運(yùn)用抗生素、適當(dāng)補(bǔ)充益生菌是重要的干預(yù)手段。