王盼雪， 孫 妍， 單錦瑞， 周甜甜

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

亞硝酸鹽是肉制品加工中一種常用的發(fā)色劑，同時也具有一定的抑菌作用[1].亞硝酸鹽可以分解產(chǎn)生亞硝基，與肌紅蛋白反應(yīng)，形成鮮紅色的亞硝基肌紅蛋白，使肉制品呈現(xiàn)良好的色澤.同時，亞硝酸鹽可以抑制肉毒梭狀芽孢桿菌及多種腐敗菌的生長，產(chǎn)生一定的防腐效應(yīng)[2].然而，人體攝入過量的亞硝酸鹽會對健康產(chǎn)生危害[3].亞硝酸鹽是一種強(qiáng)氧化劑，可以與血液中的血紅蛋白結(jié)合，使氧合血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而失去運(yùn)輸氧氣的功能，引起組織缺氧.而且，亞硝酸鹽容易與胺結(jié)合，生成具有致癌性亞硝胺.

目前，一些國家已經(jīng)禁止在肉制品中添加亞硝酸鹽，大部分國家制定了亞硝酸鹽使用量的限量標(biāo)準(zhǔn).我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760-2014)規(guī)定，肉制品中亞硝酸鹽的使用量不得超過0.15 g/kg，西式火腿類制品中最終的殘留量不超過70 mg/kg，肉類罐頭中不超過50 mg/kg，其他肉制品中不得超過30 mg/kg.然而，亞硝酸鹽廉價易得，效果顯著，不法商販在利益的驅(qū)使下，違反國家標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)，在肉制品加工過程中不規(guī)范使用亞硝酸鹽，給消費者的身體健康造成了威脅.因此，建立一種靈敏的亞硝酸鹽檢測方法對保障食品安全和民眾身體健康具有重要的意義.

目前開發(fā)的亞硝酸鹽的檢測方法包括分光光度法[4,5]、離子色譜法[6,7]、高效液相色譜法[8]、化學(xué)發(fā)光法[9,10]、毛細(xì)管電泳法[11]、催化熒光分析法[12]、電化學(xué)方法[13]等.其中，鹽酸萘乙二胺法經(jīng)濟(jì)、方便，是亞硝酸鹽檢測中最常用的分析方法[14,15].該方法的原理是，在弱酸性條件下，亞硝酸根與對氨基苯磺酸進(jìn)行重氮化反應(yīng)，生成的重氮鹽再與鹽酸萘乙二胺偶合，生成紫紅色的化合物，利用該化合物在538 nm處的吸光值分析亞硝酸鹽的含量.該方法不需要使用大型的儀器設(shè)備，檢測成本低.然而，該方法分多步進(jìn)行，操作相對繁瑣，且靈敏度低，無法滿足實際檢測的需求[16,17].

在酸性條件下，亞硝酸鹽可以與硫醇化合物反應(yīng)，生成S-亞硝基硫醇，S-亞硝基硫醇的水溶液在330～350 nm處有吸收峰[18,19].然而，烷基亞硝基硫醇的摩爾吸光系數(shù)小，吸光值低，檢測靈敏度低.Zhang等人發(fā)現(xiàn)，含有共軛結(jié)構(gòu)的化合物的摩爾吸光系數(shù)大，吸光值高[20].因此，本研究選用含有π-共軛結(jié)構(gòu)的2-硫代巴比妥酸(TBA)為反應(yīng)物，在酸性條件下與亞硝酸鹽反應(yīng)，生成吸光值高的S-亞硝基硫醇化合物(圖1).利用分光光度法測定生成的S-亞硝基硫醇化合物的吸光值，實現(xiàn)亞硝酸鹽的靈敏檢測.并利用該方法檢測市售豬肉火腿中亞硝酸鈉的含量.研究結(jié)果可以為亞硝酸鹽的檢測提供一種更為靈敏、便捷、環(huán)保的分光光度檢測方法，具有良好的應(yīng)用前景.

圖1 酸性條件下，2-硫代巴比妥酸與亞硝酸鹽反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)方程式

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

亞硝酸鈉(99%)、TBA、三水合亞鐵氰化鉀,上海阿拉丁生化科技有限公司；硝酸鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水硫酸鈉、無水碳酸鉀、無水乙酸鈉,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、七水合硫酸鋅,天津市天力化學(xué)試劑有限公司.以上試劑均為分析純.

1.1.2 主要儀器

FC全波長酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技有限公司；XW-80A旋渦混合器,上海馳唐電子有限公司；KH5200數(shù)控超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司.

1.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

(1)最適檢測波長的確定：10.0μg/mL NaNO2溶液與等體積的200μg/mL TBA溶液充分混合，測定反應(yīng)液在300～500 nm間的吸收光譜，確定最適檢測波長.

(2)TBA濃度的影響：10.0μg/mL NaNO2溶液與等體積的不同濃度的TBA溶液(50、80、100、160、200、300、400、500、1 000μg/mL)充分混合，在最適檢測波長下測定TBA溶液和反應(yīng)液吸光度，確定最佳的TBA濃度.

(3)最適反應(yīng)pH的選擇：10.0μg/mL NaNO2水溶液與等體積的pH 2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.6的200μg/mL TBA溶液反應(yīng)，在最適檢測波長下測定反應(yīng)液吸光值，確定反應(yīng)的最適pH.

(4)最優(yōu)反應(yīng)時間的確定：10.0μg/mL NaNO2溶液與等體積的200μg/mL TBA溶液室溫反應(yīng)不同時間0、5 min、10 min、20 min、40 min、80 min、100 min，在最適檢測波長下測定反應(yīng)液吸光值，確定最佳反應(yīng)時間.

1.3 共存離子干擾

測定反應(yīng)體系中分別存在濃度為1 000倍亞硝酸根濃度的硝酸鈉、無水硫酸鈉、無水碳酸鈉、無水乙酸鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鈉時，10.0μg/mL NaNO2溶液與等體積的200μg/mL TBA溶液室溫反應(yīng)20 min后，測定在最適檢測波長處的吸光值.相同試驗條件下，10.0μg/mL NaNO2溶液與等體積的200μg/mL TBA的反應(yīng)液作為陽性對照組.同時單獨測定100μg/mL干擾離子與200μg/mL TBA溶液在相同試驗條件下的反應(yīng)液的吸光值，驗證反應(yīng)的特異性.

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

濃度為0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.6μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、10.0μg/mL NaNO2的水溶液與等體積的200μg/mL的TBA的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.0)溶液充分混合，室溫反應(yīng)20 min.測定反應(yīng)液在最適檢測波長下的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.按照公式(1)和(2)計算該方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ).

LOD=3SD/k

(1)

LOQ=10SD/k

(2)

式(1)、(2)中：SD為空白組的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率.

1.5 實際樣品檢測

從超市購買兩種不同品牌的火腿，分別稱取3×3份1.0 g樣品切碎，加入0，20μg、30μg亞硝酸鈉，和9 mL蒸餾水，超聲提取30 min.加入1 mL 106 g/L的亞鐵氰化鉀，渦旋30 s，加入1 mL 53.5 g/L的硫酸鋅，渦旋30 s.室溫下反應(yīng)15 min，濾紙過濾.取200μL濾液加入等體積 200μg/mL TBA室溫反應(yīng)20 min.取200μL反應(yīng)液加入96孔板中，測定最適檢測波長處的吸光值.利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算亞硝酸鈉的含量.每份樣品平行檢測三次.加標(biāo)的樣品的回收率按照公式(3)計算.

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 最適檢測波長

在300～500 nm波長下分別采集10.0μg/mL NaNO2溶液和200μg/mL TBA溶液以及兩者等比混合的反應(yīng)液的吸收光譜(圖2).從圖2可以看出，在測定的波長范圍內(nèi)NaNO2溶液的吸光值接近零，NO2-與TBA反應(yīng)生成的亞硝基硫醇在338 nm處的吸光值最大.同時，在該波長下TBA溶液的吸光值幾乎為零.因此，可以選擇338 nm作為最適檢測波長.

圖2 亞硝酸鈉、TBA及兩者的反應(yīng)液的在300～500 nm 波長下吸收光譜

2.1.2 TBA濃度的影響

圖3給出了10.0μg/mL NaNO2溶液與等體積的不同濃度的TBA溶液(50μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、160μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、1 000μg/mL)反應(yīng)后的反應(yīng)液在338 nm的吸光值的測定結(jié)果.從圖3可以看出，當(dāng)TBA的濃度低于200μg/mL時，反應(yīng)液的吸光值隨TBA濃度的增加而顯著升高(P<0.01).當(dāng)TBA的濃度繼續(xù)增加到1 000μg/mL時，TBA溶液的背景吸收顯著升高(P<0.01)，反應(yīng)液的吸光值與TBA溶液的背景吸光值同步升高，然而扣除TBA溶液的背景吸收后，反應(yīng)液的吸光值無顯著差異(P>0.05).該結(jié)果表明，200μg/mL的TBA既可以保證樣品中的亞硝酸根反應(yīng)完全，同時背景的吸光值接近零，不會對檢測產(chǎn)生干擾.因此，測定亞硝酸根的最適TBA濃度為200μg/mL.

圖3 不同濃度的TBA及其與亞硝酸鈉反應(yīng)液的吸光值

2.1.3 最適反應(yīng)pH

利用0.1 mol/L的檸檬酸和0.2 mol/L的磷酸氫二鈉配置pH為2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.6的緩沖溶液.利用以上緩沖液分別配置200μg/mL TBA溶液.取等體積的10.0μg/mL NaNO2水溶液和TBA溶液充分混合均勻，測定混合液在338 nm下的吸光度值(圖4).從圖4可以看出，當(dāng)pH從2.6升高到4.0時，反應(yīng)液吸光度值呈增加趨勢，當(dāng)pH 繼續(xù)升高到6.0時，反應(yīng)液的吸光值隨pH的升高而下降，pH值在6.0～7.6之間時，反應(yīng)液的吸光值幾乎為零.因此，該方法的最適檢測pH為4.0.

圖4 pH對亞硝酸鈉和TBA反應(yīng)的影響

2.1.4 最優(yōu)反應(yīng)時間

為確定最優(yōu)反應(yīng)時間，試驗中10.0μg/mL NaNO2溶液和等體積的200μg/mL TBA溶液分別在室溫條件下反應(yīng)了0、5 min、10 min、20 min、40 min、80 min、100 min.反應(yīng)結(jié)束后，測定了反應(yīng)液在338 nm處的吸光值(圖5).由圖5可知，反應(yīng)時間在0～20 min時，反應(yīng)液的吸光值迅速增長，反應(yīng)時間在20～100 min時，反應(yīng)液的吸光值趨于平穩(wěn).因此，可以選擇20 min做為最優(yōu)反應(yīng)時間.

圖5 反應(yīng)不同時間的亞硝酸鈉和TBA的反應(yīng)液在338 nm處的吸光值

2.2 常見陰離子的影響

在pH4.0的條件下，測定反應(yīng)體系中分別存在濃度為1 000倍亞硝酸根濃度的硝酸根、硫酸根、碳酸根、碳酸氫根、氯離子、磷酸根、磷酸二氫根、檸檬酸根、醋酸根時，10.0μg/mL NaNO2溶液與等體積的200μg/mL TBA溶液室溫反應(yīng)20 min后的吸光值(圖6).圖6中誤差線為測定值的3%.從圖6可以看出，在檢測誤差不超過3%的條件下，測定的陰離子對亞硝酸根檢測幾乎無干擾.表明該方法對亞硝酸鹽檢測的特異性好.而且，單獨測定其他離子與TBA的反應(yīng)液的吸光值發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)液吸光值很低(圖7)，說明該反應(yīng)對亞硝酸根具有較高的專一性.

圖6 常見陰離子對亞硝酸根和TBA反應(yīng)的影響

圖7 亞硝酸根和TBA反應(yīng)的特異性驗證

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定濃度為0.1～10.0μg/mL NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液與200μg/mL TBA溶液反應(yīng)后的反應(yīng)液在338 nm處的吸光值.以NaNO2的濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)液吸光度值為縱坐標(biāo)，可擬合得到線性方程y=0.294 7x+0.083 2,R2=0.998 2(圖8).該結(jié)果表明本研究建立的亞硝酸鹽檢測方法的線性范圍比常用的鹽酸萘乙二胺方法寬[4]，使用更方便.按照公式(1)和(2)分別計算該方法的LOD為0.02μg/mL，LOQ為0.06μg/mL.

圖8 亞硝酸鈉檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 實際樣品檢測

本試驗檢測的肉制品為市售的兩種不同品牌的火腿樣品.測定結(jié)果如表1所示.從表1可以看出，該方法的檢測結(jié)果與國標(biāo)方法的檢測結(jié)果具有較高的一致性.利用該方法檢測的樣品1中亞硝酸鈉的含量為5.4μg/mL，樣品2中亞硝酸鈉含量為4.0μg/mL.兩種樣品中亞硝酸根含量均小于30 mg/kg，符合國家標(biāo)準(zhǔn)中對火腿類制品亞硝酸根含量的規(guī)定.加標(biāo)回收試驗結(jié)果顯示該方法的回收率為85.0%～94.0%，RSD為1.8%～3.0%，表明該方法的準(zhǔn)確性和精密度良好，可以作為一種亞硝酸鹽檢測的新方法.

表1 兩種市售豬肉火腿中亞硝酸鈉的檢測結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本研究以TBA為反應(yīng)物，通過亞硝酸根-硫醇反應(yīng)，向亞硝酸根中引入共軛結(jié)構(gòu)，提高亞硝基的紫外吸收值，從而建立了一種靈敏的亞硝酸鹽的分光光度檢測方法.利用該方法檢測亞硝酸鹽的最適波長為338 nm，最適pH 4.0，反應(yīng)時間為20 min，線性范圍為0.1～10.0μg/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.99，檢出限和定量限分別為0.02μg/mL，和0.06μg/mL.利用該方法檢測肉制品中亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率為85.0%～94.0%，RSD為1.8%～3.0%.該方法回收率高，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，操作簡便，可以作為肉制品及其他食品中亞硝酸鹽檢測的一種新方法.