黎玉梅,宋 昱,溫嘉童,曹洪玉,于大永,史麗穎

(1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧 大連 116622)(2.大連大學(xué)藥物研究所,遼寧 大連 116622)

真核細(xì)胞延伸因子-2激酶(Eukaryotic elongation factor-2 kinase,eEF2K)是由eEF2K基因編碼的一種鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶,屬于非典型Ser/thr蛋白激酶家族[1]. eEF2K可以通過磷酸化真核生物延伸因子2(Eukaryotic elongation factor 2,eEF2)或自磷酸化來調(diào)節(jié)肽鏈伸長(zhǎng)速率,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成[2]. 近年來,越來越多的研究表明,eEF2K能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、發(fā)育、血管生成和對(duì)化療的抵抗[3-5]. 此外,eEF2K抑制劑可以被認(rèn)為是治療惡性膠質(zhì)瘤的一種潛在策略[6]. eEF2K作為一個(gè)潛在的新型抗癌藥物靶點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞的生存和繁殖過程中具有極其重要的作用,已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注. Guo等[7]通過虛擬高通量篩選研究發(fā)現(xiàn)了β-苯丙氨酸母核支架,并設(shè)計(jì)和合成了46種丙氨酸類衍生物,評(píng)估了對(duì)這些衍生物對(duì)eEF2K的抑制活性和細(xì)胞毒性,并證明了這種新的小分子可作為eEF2K靶向抑制劑,故在此基礎(chǔ)上本研究首次通過分子模擬技術(shù)高效優(yōu)化設(shè)計(jì)更高活性的苯丙酸類eEF2K抑制劑.

分子對(duì)接(Molecular docking)是通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)研究小分子(配體)與生物大分子(受體)之間的相互作用,預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)的一種重要方法[8]. 分子對(duì)接可以有效地確定與靶蛋白活性部位空間和電性特征互補(bǔ)匹配的小分子化合物,也是進(jìn)一步探討蛋白與藥物分子間的相互作用的有效手段. 三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)被廣泛應(yīng)用于藥物分子結(jié)構(gòu)與活性的研究,以此來設(shè)計(jì)具有更高活性的藥物分子. 比較分子場(chǎng)法(Comparative molecular field anlysis,CoMFA)和比較分子相似指數(shù)分析法(Comparative molecular similarity indices analysis,CoMSIA)是目前最為通用的3D-QSAR研究方法,這兩種方法根據(jù)藥物分子周圍力場(chǎng)的差異,對(duì)藥物活性進(jìn)行探測(cè)分析得到小分子配體與受體之間的相互作用關(guān)系,進(jìn)而為設(shè)計(jì)更有效的藥物提供依據(jù).

本文以前期同源模建研究中構(gòu)建的eEF2K蛋白晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),采用分子對(duì)接方法研究了28個(gè)苯丙酸類eEF2K抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)與eEF2K之間的相互作用方式,進(jìn)一步利用CoMFA和CoMSIA方法針對(duì)這28個(gè)抑制劑構(gòu)建3D-QSAR模型,分析了苯丙酸類eEF2K抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性之間的定量關(guān)系,同時(shí)根據(jù)CoMFA和CoMSIA模型所提供的立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)和氫鍵受體場(chǎng)等信息提出優(yōu)化此類抑制劑活性的藥物設(shè)計(jì)思路,為新型eEF2K抑制劑的研究、開發(fā)與結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供理論依據(jù).

1 材料方法

1.1 eEF2K蛋白及小分子準(zhǔn)備

以前期通過同源模建方法所構(gòu)建的eEF2K蛋白為基礎(chǔ),利用Schordinger軟件包中的Protein Preparation Wizard工具對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行補(bǔ)全不完整殘基、刪除多余蛋白構(gòu)象、加氫、分配相關(guān)電荷和能量最小化處理,從而獲得適合分子對(duì)接的eEF2K晶體結(jié)構(gòu). 本實(shí)驗(yàn)所需28個(gè)小分子均由文獻(xiàn)[7]獲得(表1),包括用作訓(xùn)練集的活性小分子23個(gè),用作測(cè)試集的活性小分子5個(gè). 文獻(xiàn)所提供活性值為IC50值,根據(jù)研究所需,將這些活性值轉(zhuǎn)化為pIC50值(-log IC50). 分子構(gòu)建及結(jié)構(gòu)優(yōu)化通過SYBYL-X 2.0軟件完成,首先以最陡下降法(Steepest Descent Method)來尋找分子低能構(gòu)象,收斂RMS參數(shù)為0.05 kcal·mol-1·?-1,最大迭代步數(shù)(Max Iterations)為6 000,其余參數(shù)為缺省值;隨后使用共軛梯度法進(jìn)一步優(yōu)化分子構(gòu)象,收斂RMS參數(shù)為0.001 kcal·mol-1·?-1,最大迭代步數(shù)(Max Iterations)為1000,其余參數(shù)為缺省值;最后利用Gasteiger-Hückel法計(jì)算分子電荷,即得能量最低的藥物分子構(gòu)象.

1.2 分子對(duì)接

由于本實(shí)驗(yàn)所用eEF2K蛋白是通過同源模建技術(shù)獲得,不含原配體小分子,因此需借助Schrodinger 2017軟件包中的Sitmap程序分析目標(biāo)蛋白最具潛力的活性位點(diǎn),隨后利用Receptor Grid Generation工具在最合適的活性位點(diǎn)處定義作用網(wǎng)格,此范圍內(nèi)的氨基酸殘基即構(gòu)成了相關(guān)的活性口袋. 分子對(duì)接部分通過Ligand Docking模塊完成,利用該模塊中的Docking-Score打分函數(shù)評(píng)價(jià)抑制劑分子與eEF2K蛋白的相互作用,Docking-Score函數(shù)綜合考慮了氫鍵作用、疏水作用、靜電作用和共軛等因素,該值負(fù)值愈大,說明抑制劑分子與靶蛋白的對(duì)接復(fù)合物越穩(wěn)定,匹配結(jié)合作用越好[9]. 最后利用Ligand Interactin Diagram工具分析對(duì)接過程中抑制劑分子與eEF2K受體之間的相互作用方式.

1.3 分子疊合

分子疊合效果是構(gòu)建3D-QSAR模型的關(guān)鍵,為使分子疊合效果好,實(shí)驗(yàn)值需依據(jù)藥效團(tuán)位置、力場(chǎng)等因素進(jìn)行疊合. 本實(shí)驗(yàn)中使用SYBYL-X 2.0軟件中Align Database程序進(jìn)行分子疊合,使28個(gè)抑制劑分子的公共部分疊合在同一剛型骨架上. 由于3D-QSAR模型假定每一個(gè)活性分子以同樣的結(jié)合方式與受體的同一活性位點(diǎn)結(jié)合,因此選擇活性最好的No.27小分子(pIC50:5.26)作為模板進(jìn)行分子疊合,以使疊合效果最佳.

1.4 CoMFA和CoMSIA模型的構(gòu)建

CoMFA模型將疊合好的分子置于一個(gè)正規(guī)的三維網(wǎng)格中,格點(diǎn)間距離為0.2nm. 隨后在每個(gè)格點(diǎn)中放置一個(gè)探針粒子,分別計(jì)算每個(gè)探針粒子和各個(gè)分子間的相互作用能,從而探測(cè)小分子周圍的立體場(chǎng)(Steric,S)和靜電場(chǎng)(Electrostaic,E). 與CoMFA模型不同的是,CoMSIA模型在計(jì)算探針或基團(tuán)與分子之間的相互作用時(shí)采用了與距離相關(guān)的高斯函數(shù)形式,定義了5種分子場(chǎng)進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系研究,包括立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)(Hydrophobic,H)、氫鍵受體場(chǎng)(Acceptor,A)和氫鍵供體場(chǎng)(Donor,D)[10].

本研究從28個(gè)活性分子中隨機(jī)選擇25個(gè)分子組成訓(xùn)練集,其余5個(gè)分子組成測(cè)試集,采用偏最小二乘法(PLS)針對(duì)訓(xùn)練集計(jì)算得到CoMFA和CoMSIA模型,結(jié)合pIC50活性數(shù)據(jù)及其相關(guān)場(chǎng)描述變化進(jìn)行分析. 采用留一法(Leave-One-Out,LOO)對(duì)每個(gè)格點(diǎn)上的分子場(chǎng)進(jìn)行交叉驗(yàn)證,確定最佳主成分?jǐn)?shù)(Optimal component number)和交叉驗(yàn)證的回歸系數(shù)rcv,調(diào)整柱濾值(Column filtering value,σ)使rcv最大. 一般來講,當(dāng)rcv大于0.5時(shí)認(rèn)為模型具有良好的穩(wěn)定性[11]. 之后采用非交叉驗(yàn)證法(Non-validation)預(yù)測(cè)生物活性數(shù)據(jù),并得到相關(guān)性系數(shù)r、標(biāo)準(zhǔn)偏差s、Fisher檢驗(yàn)值F對(duì)QSAR模型的擬合能力進(jìn)行評(píng)價(jià),其中r越接近1,s越小,F越大表明模型擬合能力愈好[11].

2 結(jié)果與討論

2.1 分子對(duì)接

通過Ligand Docking程序?qū)?8個(gè)苯丙酸類eEF2K抑制劑分子進(jìn)行了分子對(duì)接. 表2列舉了Docking-Score排名前十的小分子與eEF2K蛋白的相互作用方式考察結(jié)果. 圖三為對(duì)接分?jǐn)?shù)排名最高(No.21,圖1a)與活性最好(No.27,圖1b)的分子的對(duì)接結(jié)果圖與作用方式圖,其中No.27分子與氨基酸GLN119、ALA117具有氫鍵作用,與氨基酸TYR214、ILE215具有疏水作用,與氨基酸TYR219具有共軛作用,與氨基酸LYS具有Pi-cation作用. 另外,有一半以上的小分子與氨基酸ALA117、LYS153、TYR219、TYR214、ILE215發(fā)生相互作用,提示這5個(gè)氨基酸可能是與eEF2K蛋白作用的關(guān)鍵氨基酸.

2.2 分子疊合

以活性最好的No.27小分子為疊合模板,將28個(gè)抑制劑分子的公共骨架疊合,結(jié)果如圖2所示. 所有分子的公共骨架均疊合在一起,并且化合物分子中相似基團(tuán)的疊合取向也趨于一致,說明疊合效果良好.

2.3 CoMFA和CoMSIA模型

利用PLS法對(duì)訓(xùn)練集的28個(gè)小分子建立CoMFA模型,最佳主成分?jǐn)?shù)為2、柱濾值為0.1 kJ/mol時(shí),rcv最大,為0.507,說明所建立模型具有良好的穩(wěn)定性. 以非交叉驗(yàn)證法計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.105,相關(guān)性系數(shù)r為0.851,F值為65.849,說明模型具有良好的擬合能力(表3). 模型對(duì)于抑制劑分子pIC50實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的偏差均小于1個(gè)數(shù)量級(jí)(表4),實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間的線性關(guān)系見圖3(a),其相關(guān)性系數(shù)R2為0.794,說明模型具有良好的預(yù)測(cè)能力. 另外,CoMFA模型中立體場(chǎng)(S)和靜電場(chǎng)(E)的貢獻(xiàn)率分別為29.7%和70.3%,說明eEF2K抑制劑分子周圍的靜電場(chǎng)對(duì)其活性發(fā)揮主要作用.

表3 訓(xùn)練集分子的CoMFA和CoMSIA模型數(shù)據(jù)參數(shù)Table 3 Statistical parameters of CoMFA and CoMSIA models for training set molecules

表4 CoMFA和CoMSIA模型測(cè)試集分子pIC50實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值比較Table 4 Comparison of actual and predicted pIC50 value of the test sets molecules for the CoMFA and CoMSIA models

利用PLS法對(duì)訓(xùn)練集的28個(gè)小分子建立CoMSIA模型,最佳主成分?jǐn)?shù)為2、柱濾值為0.3 kJ/mol時(shí),rcv最大,為0.565,說明所建立模型具有良好的穩(wěn)定性. 以非交叉驗(yàn)證法計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.128,相關(guān)性系數(shù)r為0.834,F值為48.920,說明模型具有良好的擬合能力(表3). 模型對(duì)于抑制劑分子pIC50實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的偏差均小于1個(gè)數(shù)量級(jí)(表4),實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間的線性關(guān)系見圖3(b),其相關(guān)性系數(shù)R2為0.696,說明模型具有良好的預(yù)測(cè)能力. 另外,CoMSIA模型中立體場(chǎng)(S)、靜電場(chǎng)(E)、疏水場(chǎng)(H)、氫鍵供體場(chǎng)(D)和氫鍵受體場(chǎng)(A)的貢獻(xiàn)率分別為4.9%、44.7%、22.0%、10.9%和17.5%,CoMSIA模型提供了更多的場(chǎng)信息,5個(gè)場(chǎng)相互作用共同影響了抑制劑分子活性,其中靜電場(chǎng)發(fā)揮主要作用.

本研究所建立的CoMFA和CoMSIA模型均具有良好的穩(wěn)定性、擬合能力和預(yù)測(cè)能力,eEF2K抑制劑分子周圍的靜電場(chǎng)對(duì)其活性發(fā)揮主要作用. 在進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)時(shí),應(yīng)綜合考慮CoMFA和CoMSIA模型提供的信息.

2.4 3D-QAR等勢(shì)圖

2.4.1 CoMFA模型等勢(shì)圖

以活性最好的No.27作為參考分子為例進(jìn)行分析,其CoMFA模型等勢(shì)圖如圖4所示. 立體場(chǎng)區(qū)域用綠色和黃色表示,黃色區(qū)域表示增大基團(tuán)會(huì)降低藥物活性,綠色區(qū)域表示增大基團(tuán)有利于增加藥物活性,因此,在16-增加支鏈來增大體積,也可引入體積較大的基團(tuán)如苯基、吡啶基等或用于替代15-氰基來增加藥物活性. 靜電場(chǎng)區(qū)域用紅色和藍(lán)色表示,紅色代表增加負(fù)電性基團(tuán)有利于增加藥物活性,藍(lán)色代表增加正電性基團(tuán)有利于增加藥物活性. 因此可以在15-引入-F、-Cl、-I等負(fù)電性基團(tuán)或在5-原子引入正電性基團(tuán)如含氮官能團(tuán)來設(shè)計(jì)理論上eEF2K抑制活性更好的藥物分子.

2.4.2 CoMSIA模型等勢(shì)圖

相較與CoMFA模型,CoMSIA模型除了立體場(chǎng)(S)和靜電場(chǎng)(E)之外,還給出了疏水場(chǎng)(H)、氫鍵供體場(chǎng)(D)和氫鍵受體場(chǎng)(A)的場(chǎng)信息. 分子場(chǎng)的貢獻(xiàn),依然選擇活性最高的No.27分子進(jìn)行分析. 圖5(a)為CoMSIA模型立體場(chǎng)與靜電場(chǎng)貢獻(xiàn)圖,場(chǎng)中所代表信息與CoMFA模型相同,可知可用體積較大的基團(tuán)替代15-氰基,用體積較小的基團(tuán)替代9-羧基來提高藥物活性,而在1-Cl處不宜引入較大基團(tuán),否則會(huì)降低藥物活性. 同時(shí)在15-引入-F、-Cl、-I等負(fù)電性基團(tuán),在14-引入正電性基團(tuán)可增加藥物活性. 圖5(b)為CoMSIA模型疏水場(chǎng)貢獻(xiàn)圖,其中白色代表增加親水性基團(tuán)有利于提高藥物活性,黃色代表增加疏水性基團(tuán)有利于提高藥物活性. 白色區(qū)域幾乎覆蓋了整個(gè)藥物分子,提示可以引入羥基、羧基、氨基等親水性基團(tuán)來增加藥物活性,而黃色區(qū)域分布于15-與16-之間,說明在15-或16-引入烷烴、環(huán)烷烴、酯基等疏水性基團(tuán)可增加藥物活性. 圖5(c)為CoMSIA模型氫鍵供體場(chǎng)和氫鍵受體場(chǎng)貢獻(xiàn)圖,藍(lán)綠色代表增加氫鍵供體有利于增加藥物活性,紅色表示增加氫鍵受體不利于藥物活性. 由此可知,在3-和13-引入氫鍵供體基團(tuán)如-OH等可增加藥物活性,而在9-、12-、15-、17-等均不宜引入氫鍵受體基團(tuán),否則會(huì)降低藥物活性.

2.5 藥物設(shè)計(jì)

依據(jù)CoMFA、CoMSIA模型等勢(shì)圖提供的藥物分子設(shè)計(jì)信息并結(jié)合eEF2K抑制劑與蛋白之間的相互作用方式,研究設(shè)計(jì)了一系列新化合物,并使用3D-QSAR模型預(yù)測(cè)這些化合物的pIC50值,最終得到3個(gè)理論上具有更好活性的eEF2K抑制劑,其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖6. 進(jìn)一步對(duì)這3個(gè)小分子與eEF2K蛋白進(jìn)行了分子對(duì)接,對(duì)接結(jié)果顯示,化合物A、B、C與eEF2K蛋白的結(jié)合能(glide energy)評(píng)價(jià)值分別為-44.424、-49.978、-59.211均低于模板分子No.27(-43.424),說明相比于模板分子這3個(gè)小分子與eEF2K蛋白結(jié)合更加穩(wěn)定,提示這3個(gè)小分子有望成為更加有效的eEF2K抑制劑.

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)藥物研發(fā)方法相比,計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)能夠顯著提高藥物設(shè)計(jì)速度,降低藥物研發(fā)成本,縮短研發(fā)周期. 而分子對(duì)接和3D-QSAR技術(shù)可對(duì)藥物研發(fā)中結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化進(jìn)行指導(dǎo),避免藥物研發(fā)的盲目性. 本文首先對(duì)具有eEF2K蛋白抑制活性的28個(gè)苯丙酸類化合物與前期同源模建所得eEF2K蛋白進(jìn)行了分子對(duì)接,初步闡明了苯丙酸類eEF2K抑制劑與靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用方式,該類抑制劑與靶點(diǎn)蛋白之間具有多種作用力,包括與PRO268、ALA117等氨基酸的氫鍵作用,與ILE215、TYR219等氨基酸的疏水作用,與ASP280等氨基酸的靜電作用,與HIS210等氨基酸的共軛作用以及與LYS153的 Pi-cation 作用等,其中有一半以上的小分子均與氨基酸ALA117、LYS153、TYR219、TYR214、ILE215發(fā)生相互作用,因此這5個(gè)氨基酸可能是與eEF2K蛋白作用的關(guān)鍵氨基酸,可作用于這些氨基酸的小分子極有可能可作為eEF2K抑制劑,該結(jié)果可用于eEF2K抑制劑的虛擬篩選,對(duì)eEF2K抑制劑的研究與開發(fā)具有指導(dǎo)意義. 筆者下一步將結(jié)合該結(jié)果構(gòu)建可用于eEF2K抑制劑虛擬篩選的藥效團(tuán)模型,以期發(fā)現(xiàn)新的eEF2K抑制劑分子. 本文還采用偏最小二乘法建立了擬合能力、穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力均良好的CoMFA和CoMSIA模型,闡明了eEF2K抑制劑分子結(jié)構(gòu)與活性之間的三維定量構(gòu)效關(guān)系,為eEF2K抑制劑分子的設(shè)計(jì)奠定了理論基礎(chǔ),并結(jié)合這兩個(gè)3D-QSAR模型中立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)和氫鍵受體場(chǎng)等勢(shì)圖所提供的藥物設(shè)計(jì)信息,設(shè)計(jì)了3個(gè)理論上具有更高活性的小分子,為設(shè)計(jì)更加有效的eEF2K抑制劑提供了新的思路.