李詩(shī)婷，郭玲通訊作者，龔琴琴，蔣澤梅，甘建妮，李俊霞，張永萍，徐劍

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng))

0 引言

子宮內(nèi)膜癌是原發(fā)于子宮內(nèi)膜上皮的女性生殖器官惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率近來(lái)年均有上升趨勢(shì)[1]。雖然目前針對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療手段不斷發(fā)展，但其總體療效不佳，病人承受很大痛苦。研究開(kāi)發(fā)療效更加顯著的腫瘤治療方法仍是醫(yī)藥工作者亟需解決的醫(yī)學(xué)難題之一。雷公藤紅素，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤、南蛇藤植物中提取的五環(huán)三萜類單體化合物[2]，是雷公藤及其制劑包括雷公藤片、雷公藤多苷片的主要有效活性成分之一。其作為一種天然蛋白酶抑制劑[3]，能有效抑制蛋白酶體活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)前列腺癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]、白血病[7]、膠質(zhì)瘤[8]、結(jié)腸癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11,12]等多種腫瘤細(xì)胞均產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤活性。然而，目前尚未見(jiàn)雷公藤紅素用于治療子宮內(nèi)膜癌的研究報(bào)道。本文擬選擇人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細(xì)胞為研究對(duì)象，考察雷公藤紅素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響，為將其開(kāi)發(fā)為子宮內(nèi)膜癌治療藥物提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Olympus BX5 型生物顯微鏡( 日 本Olympus 公 司)；MCO-17AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo 公司)；YDS-35-125 型液氮罐( 成都液氮容器廠)；BD-100LT 型低溫冷凍柜(青島海爾電冰柜有限公司)；SW-TJ 型水平流凈化工作臺(tái)(蘇州市凈化設(shè)備總廠)；AQZX-C 型空氣浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)；Allegra X-22R 型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter 公司)；Varioskan Flash 型酶標(biāo)儀( 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公 司)；CytomicsFC500 型 流 式 細(xì) 胞儀(美國(guó) Beckman Coulter 公司)。

1.2 藥品與試劑

雷公藤紅素( 成都普菲德生物科技有限公司，批號(hào)：18032109，純度：＞98.0%)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、核糖核酸酶A(RNAse A)溶液、碘化丙啶(PI)、0.25%胰酶(北京索萊寶科技有限公司)；AnnexinV-FITC/PI 雙染試劑盒(美國(guó)BD 公司)；1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗(廣州吉尼歐生物科技有限公司)；胎牛血清(美國(guó) GIBCO 公司)。

1.3 細(xì)胞株

人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細(xì)胞株購(gòu)自廣州吉尼歐生物科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室保種。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HHUA 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的1640 培養(yǎng)液中，于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代，每周約3 次，隔天更換一次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT 法檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞增殖的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HHUA 細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按每孔5 000 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)，小心棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度(0.1、0.4、1.4、6.4、25.6 μg/mL)的雷公藤紅素培養(yǎng)基溶液進(jìn)行干預(yù)，每孔200 μL，同時(shí)設(shè)置空白組(無(wú)細(xì)胞)和對(duì)照組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)36 h 后，棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 含0.5 mg/ mL MTT 的PBS 溶液，繼續(xù)孵育4 h。中止培養(yǎng)，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，將培養(yǎng)板置于37℃±0.5 ℃空氣浴振蕩器中振搖15 min，使結(jié)晶物甲瓚充分溶解。于酶標(biāo)儀上570 nm 處測(cè)定各孔的吸光值A(chǔ)，記錄結(jié)果。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率(%)=[(A 加藥組-A 空白組)/(A 對(duì)照組-A 空白組)]×100%

2.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

利用PI 染色法檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞周期分布的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HHUA 細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按每孔300 000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，以1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素處理細(xì)胞，同時(shí)用培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)36 h 后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，提取l mL 細(xì)胞懸液，于4 °C，2 000 rpm離心5 min，去除上清液后用預(yù)冷的75 %乙醇于4 °C 固定30 min，離心去除上清液，用PBS 洗滌，加0.3 mL PBS 重懸后加入0.l mL 0.1%Triton X-100 溶液室溫下孵育15 min 進(jìn)行打孔。孵育后再加入0.1 mL 0.1 mg/mL 的RNaseA 酶，37 °C孵育30 min 降解RNA，然后加入0.2 mL 0.1 mg/mL 的PI 染色DNA，4 °C 孵育30 min 后用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞周期分布情況，并用 ModFit LT 2.0 軟件進(jìn)行分析。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

采用AnnexinV-FITC/PI 雙染法定量評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按每孔300 000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)至80% 匯合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入含雷公藤紅素1.07 4 μg/mL 的培養(yǎng)基溶液，同時(shí)用培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。加藥培養(yǎng)36 h 后，按Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行染色，染色后樣品于1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)，*P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞增殖的影響

MTT 結(jié)果如圖1 所示，雷公藤紅素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性。雷公藤紅素處理HHUA 細(xì)胞36 h 后，細(xì)胞存活率的IC50 值為1.07 4 μg/mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在該濃度下進(jìn)行。

圖1 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞增殖的影響。(A)不同濃度雷公藤紅素處理HHUA 細(xì)胞36 h 后，MTT 法測(cè)得的細(xì)胞存活率結(jié)果。(B)雷公藤紅素干預(yù)HHUA 細(xì)胞36 h 的IC50 值。

4.2 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞周期的影響

如圖2 和表1 所示，雷公藤紅素作用HHUA 細(xì)胞36 h后，與0 μg/mL雷公藤紅素組比較，1.07 4 μg/mL雷公藤紅素組G0/G1 期細(xì)胞比例顯著增加，S 期細(xì)胞比例顯著減少(P＜0.05)。此外，當(dāng)用雷公藤紅素處理后，藥物組不僅將細(xì)胞阻滯在G0/G1 期，同時(shí)還使得Sub G1 期細(xì)胞比例增加。

圖2 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞周期的影響

4.3 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞凋亡的影響

如圖3 和表2 所示，雷公藤紅素可顯著增加細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡率。與對(duì)照組比較，1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素處理HHUA 細(xì)胞36 h 后，細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P＜0.05)。

圖3 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞凋亡的影響

表1 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞周期的影響 (%，±s，n=3)

表1 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞周期的影響 (%，±s，n=3)

注：與0 μg/mL 雷公藤紅素組比較，*P＜0.05。

組別 Sub G1 期 G0/G1 期 S 期 G2/M 期0 μg/mL 1.47±0.05 51.63±2.02 31.61±1.63 16.76±1.08 1.07 4 μg/mL 19.51±0.85* 62.73±1.27* 23.11±0.84* 14.16±0.78

表2 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞凋亡的影響 (%，±s，n=3)

表2 雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞凋亡的影響 (%，±s，n=3)

注：與0 μg/mL 雷公藤紅素組比較，*P＜0.05。

組別 早凋亡 晚凋亡 總凋亡0 μg/mL 7.4±0.9 2.3±1.0 9.8±2.0 1.07 4 μg/mL 25.2±1.4* 12.7±1.5* 37.9±1.0*

5 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20 %-30 %[13]。雷公藤紅素是中藥雷公藤的主要有效活性成分之一，經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其不僅在抗炎、免疫抑制、抗神經(jīng)退行性疾病等[14]領(lǐng)域顯示了良好的藥理活性，還在治療腫瘤等方面展示了其潛力，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對(duì)體外培養(yǎng)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞包括宮頸癌細(xì)胞[15]和卵巢癌細(xì)胞[16]均有較強(qiáng)的抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但雷公藤紅素對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的抗腫瘤作用至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究雷公藤紅素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HHUA 細(xì)胞的作用，探究臨床應(yīng)用雷公藤紅素治療子宮內(nèi)膜癌的可行性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT 法觀察了不同濃度的雷公藤紅素(0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 μg/mL)對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HHUA 的生長(zhǎng)抑制情況，并與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對(duì)HHUA 細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性，在一定的濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，抑制作用也顯著增加。

癌細(xì)胞的細(xì)胞周期處于失控狀態(tài)，這是癌細(xì)胞可以無(wú)限增殖的原因之一，抗腫瘤藥物可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制腫瘤生長(zhǎng)[17]。雷公藤紅素可將HHUA 細(xì)胞周期相對(duì)阻滯在G0/G1 期，使G0/G1 期細(xì)胞比例顯著增加，S 期細(xì)胞比例顯著減少。此外雷公藤紅素還使Sub G1 期細(xì)胞顯著增多，Sub G1期代表亞二倍體DNA 的含量，象征著細(xì)胞凋亡，說(shuō)明雷公藤紅素不僅產(chǎn)生了細(xì)胞周期阻滯作用，還誘導(dǎo)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，本課題進(jìn)一步采用AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素干預(yù)HHUA 細(xì)胞36 h 后，HHUA 細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加(P＜0.05)。

綜上所述，本研究首次探索了雷公藤紅素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細(xì)胞的抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其體外抗腫瘤作用明顯，雷公藤紅素可能通過(guò)干擾細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制HHUA 細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。后期筆者將建立動(dòng)物模型，結(jié)合體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探索雷公藤紅素對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療作用，并探究雷公藤紅素阻滯細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。