張 瑞，陳 晨，宋虎偉，李 起，張 東，李文智，王 林，耿智敏

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院：1. 肝膽外科；2. 老年外科，陜西西安 710061)

膽囊癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，發(fā)病率居于膽道系統(tǒng)腫瘤的首位，5年生存率僅為5%[1]。由于發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在就診時已處于晚期，常伴有淋巴轉(zhuǎn)移。淋巴轉(zhuǎn)移是膽囊癌最常見的轉(zhuǎn)移方式，也是影響患者預后的獨立危險因素之一[2]。因此，研究淋巴轉(zhuǎn)移機制，尋找相關(guān)診斷和治療的分子標志物，對于膽囊癌的診治具有重要的臨床意義。而目前尚不清楚膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移的分子機制[3]。近期研究表明，淋巴內(nèi)皮細胞(lymphatic endothelial cells, LECs)參與腫瘤細胞與淋巴管的相互作用，并在腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4]。

間質(zhì)纖維化反應是許多實體腫瘤的生物學特性，已有大量研究證實膽管癌、胰腺癌、肝癌等多種腫瘤具有顯著的纖維化特征[5-7]，膽囊癌亦有明顯的間質(zhì)纖維化反應，這與腫瘤間質(zhì)中成纖維細胞含量密切相關(guān)。腫瘤相關(guān)性成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分之一，參與了腫瘤細胞增殖、腫瘤免疫、血管生成、淋巴轉(zhuǎn)移和耐藥性等多個過程[8-9]。本課題組在前期研究中通過酶消化法從患者離體膽囊癌組織中成功地提取出CAFs，并證實其可以明顯促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[10]。目前尚不清楚CAFs對膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響及機制。本研究在前期研究基礎上，進一步研究CAFs對LECs遷移的影響及可能的相關(guān)機制，旨在闡明膽囊癌的淋巴轉(zhuǎn)移機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2009年1月至2011年12月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治住院的膽囊癌患者手術(shù)切除的組織標本83例，術(shù)中取材后立即保存于40 g/L多聚甲醛中。所有組織標本均經(jīng)病理證實為膽囊癌。本課題經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核。所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及實驗試劑人淋巴管內(nèi)皮細胞(human lymphatic endothelial cells, HLECs)購自中科院上海細胞庫。實驗所用的膽囊癌CAF及膽囊成纖維細胞(normal fibroblasts, NFs)通過酶消法分別從膽囊癌和膽囊慢性炎癥組織中進行原代提取。F12、RPMI 1640及胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；重組人IGFBP3購自以色列PROSPEC公司；2-Deoxy-D-glucose(2-DG, IGFBP3抑制劑)購自中國上海陶素生化科技有限公司；RIPA裂解液(強)購自西安赫特生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜和ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；Transwell小室購自美國Corning公司；兔抗人α-SMA和IGFBP3購自CST公司；SP9000免疫組化試劑盒(包括封閉用山羊血清、生物素、標記二抗和辣根酶標記鏈酶卵白素)購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；Western blotting所用的β-actin、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin一抗購自美國Sigma公司；二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；IGFBP3、IL6和TGF-β三種ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司。

1.3 細胞提取、培養(yǎng)和分組課題組前期通過酶消化法從患者離體的膽囊癌組織中成功提取到腫瘤成纖維細胞(CAF)[10]。本研究中用同樣的方法分別從膽囊癌組織和膽囊慢性炎癥組織中提取CAFs和NFs。首先收集患者因膽囊癌和膽囊結(jié)石或慢性炎癥行手術(shù)切除的膽囊組織標本，將組織剪碎至1 mm3大小碎片，放置于含20 μL/mL DNaseI的Ⅱ型膠原酶(1 mg/mL)中，37 ℃孵育4 h，離心后再重懸于完全培養(yǎng)基，應用胰酶消化法和差速貼壁法對成纖維細胞進行純化。培養(yǎng)48 h，收集相應的條件培養(yǎng)基。CAF、NF和HLEC細胞分別用含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的F12和RPMI 1640培養(yǎng)基，于50 mL/L CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分組：空白對照組(正常培養(yǎng)基組)、CAF-CM(CAF條件培養(yǎng)基)組、NF-CM組(NF條件培養(yǎng)基)、IGFBP3組(正常培養(yǎng)基里加入100 ng/mL IGFBP3)、CAF-CM+2-Deoxy-D-glucose(加入5 mmol/L 2-Deoxy-D-glucose)聯(lián)合干預組。

1.4 Transwell小室遷移實驗用無血清培養(yǎng)基重懸HLEC細胞并調(diào)整細胞密度約為5×105/mL。在Transwell小室的上室每孔加入200 μL細胞懸液(約1×105個細胞)；分組同1.3項，設3個復孔，將細胞置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，取出小室，棄去上室中的培養(yǎng)液，用棉簽拭去小室上層殘存的細胞；多聚甲醛固定細胞20 min，結(jié)晶紫染色20 min，充分漂洗多余的染液，顯微鏡下隨機觀察10個視野計數(shù)，并取均數(shù)。以上實驗重復3次。

1.5 劃痕實驗取對數(shù)生長期的HLEC細胞，以5×105個/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h后用200 μL槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字劃痕，PBS清洗細胞3次，去除殘留的細胞，更換為相應培養(yǎng)基，分組同1.3項。置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于0、24 h分別拍照，計算劃痕閉合率。ImageJ軟件計算細胞遷移率(%)=[(0～24)h的面積/0 h的起始面積]×100%。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達將HLEC細胞根據(jù)1.3項分組做相應處理，72 h后收集細胞，用RIPA裂解液將細胞充分裂解后提取蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。將待檢測蛋白樣品上樣后，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜；50 g/L脫脂牛奶室溫下封閉2 h后，加入按適當比例稀釋的一抗β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin(均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST清洗膜后加適當比例稀釋的二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗膜后進行化學發(fā)光顯影。

1.7 ELISA檢測常見的CAFs分泌因子的含量按相關(guān)文獻報道[11-12]進行ELISA實驗。將對數(shù)生長期CAF、NF細胞接種于24孔板中培養(yǎng)48 h后，收集上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，分別測定相應上清液中IGFBP3、IL-6和TGF-β水平，實驗重復3次，取平均值。

1.8 半定量細胞因子芯片檢測按相關(guān)文獻報道[11-12]，對膽囊癌CAF和NF上清進行相關(guān)細胞因子芯片半定量檢測，篩選差異細胞因子。將對數(shù)生長期CAF、NF細胞接種于24孔板中培養(yǎng)48 h后，收集上清液，采用北京博奧晶典生物公司提供的RayBiotech人半定量細胞因子芯片AAH-CYT-G5-8進行常見細胞因子檢測，按照芯片說明書操作，抗體芯片樣本圖像用掃描儀進行掃描，提取芯片數(shù)據(jù)，應用掃描儀配套的分析軟件計算出每個有表達意義細胞因子的差異倍數(shù)值，按差異倍數(shù)值>2.0倍表示該細胞因子表達上調(diào)，差異倍數(shù)值<0.5倍表示該細胞因子表達下調(diào)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.9 免疫組織化學檢測以α-SMA標記CAFs，染色程度提示CAFs在膽囊癌和癌旁組織中的含量。將膽囊癌及癌旁組織標本包埋成蠟塊，制作成相應的組織芯片，進行免疫組化實驗：組織芯片脫蠟-脫水后，30 mL/L H2O2孵育10 min，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液微波修復20 min；山羊血清封閉15 min后滴加適當比例稀釋的一抗(α-SMA 1∶400；IGFBP3 1∶800)，放于4 ℃冰箱中過夜；第2天將芯片復溫后依次加入二抗和辣根酶標記鏈酶卵白素孵育后，DAB顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.10 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組樣本比較采用方差分析和多重比較(Dunnett-t檢驗)分析每組與對照組之間的差異；α-SMA表達與臨床病例資料間的相關(guān)分析采用χ2檢驗和Fisher’s確切概率檢驗。利用GraphPad Prism 7進行圖表繪制，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CAF-CM促進LEC細胞遷移Transwell遷移和劃痕實驗評價CAF-CM對LEC細胞遷移能力的影響。劃痕實驗結(jié)果顯示，CAF-CM組劃痕閉合率[(51.01±5.72)%]明顯高于對照組[(19.88±2.80)%]和NF-CM組[(23.6±3.45)%]，差異有統(tǒng)計學意義(圖1A，P<0.05)；同樣，Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，CAF-CM組穿膜細胞數(shù)[(106.80±5.53)個]明顯高于對照組[(75.00±6.32)個]和NF-CM組[(83.60±4.40)個]，差異有統(tǒng)計學意義(圖1B，P<0.01)，說明CAF-CM可以明顯增強LEC細胞的遷移能力。

2.2 CAF-CM對LEC細胞中遷移相關(guān)蛋白表達的影響與對照組和NF-CM組相比，CAF-CM組的LEC細胞中E-cadherin的表達明顯降低；同時N-cadherin和Vimentin的表達顯著升高，表明CAF-CM可以促進LEC細胞的EMT轉(zhuǎn)化，進而引起細胞遷移(圖1C)。

2.3 CAF-CM和NF-CM中分泌蛋白因子的檢測通過人半定量細胞因子芯片檢測兩種細胞上清液中HGF、IGFBP3、CSF2、TGF-β、IL-6、IL-8等常見細胞因子的含量，根據(jù)芯片熒光雜交點陣和樣品信號結(jié)果提示CAF-CM中IGFBP3(P<0.01)、IL-8(P<0.05)含量明顯高于NF-CM，且兩種因子信號值存在明顯差異(圖2A、圖2B)。本研究主要觀察IGFBP3在CAFs與LECs相互作用中的影響。

結(jié)合相關(guān)文獻報道，進一步通過ELISA實驗驗證常見的CAFs分泌細胞因子的含量，結(jié)果顯示，CAF和NF細胞上清液中IGFBP3分泌量分別為(3 928.2±332.8)pg/mL和(2 473.0±220.3)pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而IL-6和TGF-β分泌量在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2C)。

圖1 CAF-CM對LEC細胞遷移能力及EMT通路相關(guān)蛋白表達的影響

圖2 RayBiotech人半定量細胞因子芯片檢測CAF-CM中顯著變化的細胞因子情況

2.4 CAFs在膽囊癌和癌旁組織中的表達及其與臨床病例特征的關(guān)系以α-SMA標記CAFs染色程度提示CAFs在膽囊癌和癌旁組織中的含量。免疫組化檢測結(jié)果顯示：α-SMA在膽囊癌組織中陽性表達59例，陽性率為71.08%，癌旁組織中陽性表達34例，陽性率為53.13%，兩組之間α-SMA陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IGFBP3在膽囊癌中陽性表達55例，陽性率為66.27%，癌旁組織中陽性表達29例，陽性率為45.31%，兩組之間IGFBP3陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 膽囊癌組織及癌旁組織中α-SMA和IGFBP3的表達與比較

根據(jù)α-SMA和IGFBP3染色程度，將83例膽囊癌組織分為α-SMA高表達組(n=59)和α-SMA低表達組(n=24)；IGFBP3高表達組(n=55)和IGFBP3低表達組(n=28)。結(jié)合膽囊癌患者的臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)：膽囊癌中α-SMA表達與性別、年齡、病理類型、腫瘤分級、肝臟浸潤不相關(guān)(P>0.05)，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和IGFBP3表達顯著相關(guān)(P<0.05，表1)。

2.5 CAF-CM中的IGFBP3促進LEC細胞的遷移Transwell遷移實驗結(jié)果表明，相較于對照組穿膜細胞數(shù)(91.20±4.25)個，CAF-CM組穿膜細胞數(shù)(117.00±6.91)個、IGFBP3組穿膜細胞數(shù)(115.00±4.46)個明顯增多(圖4A，P<0.05)，同時在CAF-CM中加入IGFBP3的抑制劑2-DG[(86.4±6.00)個]可以逆轉(zhuǎn)CAF-CM對LEC細胞遷移的影響，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同樣，劃痕實驗結(jié)果顯示，相較于對照組劃痕閉合率(23.84±3.40)%，CAF-CM組劃痕閉合率(63.97±6.39)%、IGFBP3組劃痕閉合率(59.23±5.08)%明顯增高(圖4B，P<0.01)，同時CAF-CM+2-DG組劃痕閉合率[(26.39±4.63)%]明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明CAF-CM中IGFBP3可以明顯增強LEC細胞的遷移能力，加入IGFBP3抑制劑后可以明顯逆轉(zhuǎn)這種效應。

表1 膽囊癌α-SMA表達與膽囊癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between α-SMA expression and clinicopathological features of the patients with gallbladder carcinoma

圖4 IGFBP3對LEC細胞遷移能力及EMT通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.6 CAF-CM中的IGFBP3對LEC細胞中EMT相關(guān)蛋白的影響與對照組相比，CAF-CM組和IGFBP3組的LEC細胞中E-cadherin的表達明顯降低；而N-cadherin和Vimentin的表達則明顯升高；同時在CAF-CM中加入2-DG后，LEC細胞中的3種蛋白表達出現(xiàn)恢復(圖4C)。這表明，CAF-CM中IGFBP3主要通過影響EMT轉(zhuǎn)化促進LEC細胞的遷移。

3 討 論

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)，也稱為腫瘤基質(zhì)或腫瘤間質(zhì)，包括成纖維細胞、免疫細胞、血管、淋巴管和細胞外基質(zhì)，對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響[13]。CAFs是腫瘤間質(zhì)的重要組成成分之一，不僅為腫瘤細胞提供物理支撐，同時也是腫瘤關(guān)鍵的功能調(diào)節(jié)劑，可以通過直接分泌和旁分泌方式調(diào)節(jié)腫瘤細胞和其他基質(zhì)細胞的生物學特性，釋放出多種調(diào)節(jié)因子，合成和重塑細胞外基質(zhì)，從而影響腫瘤的啟動和發(fā)展。膽道惡性腫瘤具有間質(zhì)纖維化的特征[5,14]，在膽管癌的研究中已發(fā)現(xiàn)CAFs可以明顯促進腫瘤細胞的多種生物過程，如增殖、侵襲和EMT[15-18]。但在膽囊癌中CAFs的相關(guān)報道較少，本課題組前期通過組織塊法和酶消化法建立了人CAFs的原代培養(yǎng)方法，從膽囊癌組織中成功提取出CAF細胞，并發(fā)現(xiàn)CAFs可明顯促進膽囊癌細胞增殖和侵襲。

轉(zhuǎn)移是膽囊癌預后不良的主要原因。大量研究表明，導致腫瘤轉(zhuǎn)移存在多種機制，但主要途徑仍是通過血液和淋巴管進行轉(zhuǎn)移[19]。與血管不同，淋巴管是由單層內(nèi)皮細胞構(gòu)成的，缺乏基底膜、周細胞或平滑肌細胞，更易于產(chǎn)生腫瘤細胞的浸潤[20]。STACKER等[21]認為新生淋巴管的形成和現(xiàn)有淋巴管的重塑是癌癥淋巴轉(zhuǎn)移的兩個重要步驟。淋巴管新成是指從先前存在的淋巴管生成新淋巴管，涉及LECs的增殖、遷移和出芽生長；而現(xiàn)有淋巴管的重塑主要是LEC細胞在多種細胞因子的作用下發(fā)生遷移的過程。在淋巴轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞先侵入周圍的淋巴小管，然后到達鄰近的引流淋巴結(jié)，隨著淋巴液或者血液循環(huán)而出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。LECs在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其增殖和遷移有助于淋巴管的萌發(fā)，而淋巴管生成和淋巴液增多促發(fā)了腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移過程[21-22]。已被證實腫瘤淋巴管生成可預測區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并促進向遠處器官的擴散。近期有研究表明，CAFs可以明顯促進腫瘤淋巴管形成，MASSIMILIANO等[23]發(fā)現(xiàn)PDGF-D可刺激腫瘤成纖維細胞產(chǎn)生VEGF-C和VEGF-A，導致淋巴管擴張和腫瘤細胞浸潤，提示在膽管癌早期轉(zhuǎn)移中可通過誘導CAF凋亡或抑制PDGF-D而阻止淋巴轉(zhuǎn)移。同樣，日本一項食管癌臨床樣本的研究揭示，CAFs促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并使用原位轉(zhuǎn)移小鼠模型在體內(nèi)外驗證細胞間關(guān)系，證實了CAFs的積累明顯促進了食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[24]。然而，尚不清楚膽囊癌中CAFs與LECs之間是否存在關(guān)聯(lián)以及其作用機制。

本研究探索了CAFs對淋巴內(nèi)皮細胞遷移能力的影響及作用機制。研究發(fā)現(xiàn)CAF-CM干預LEC細胞后，其遷移能力明顯增強，顯著下調(diào)E-cadherin表達，上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達；蛋白因子芯片和ELISA結(jié)果顯示，CAF條件培養(yǎng)基與NF條件培養(yǎng)基中IGFBP3表達存在明顯差異；膽囊癌組織芯片免疫組化分析顯示α-SMA表達與淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期及IGFBP3表達存在顯著相關(guān)性；進一步進行體外實驗，研究了淋巴管生成過程的機制，結(jié)果顯示外源性的IGFBP3可以促進LEC細胞遷移，同時在CAF-CM中加入IGFBP3的抑制劑后，可以逆轉(zhuǎn)CAF-CM單獨誘導細胞遷移和遷移相關(guān)蛋白的表達。

綜上所述，本研究結(jié)合臨床組織樣本和體外細胞實驗，結(jié)果表明CAFs通過分泌IGFBP3影響EMT轉(zhuǎn)化，從而促進LEC細胞的遷移。初步闡明了IGFBP3在膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用，提示其可以作為膽囊癌抗淋巴轉(zhuǎn)移治療中一個有潛力的治療靶標，為膽囊癌的淋巴轉(zhuǎn)移機制提供新的理論依據(jù)。