王 濤，易登良，范忠才

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是一種因慢性高血糖和胰島素抵抗誘發(fā)的且排除冠狀動脈疾病、高血壓病、心臟瓣膜病等明確病因的一種特殊的心臟疾病，可逐漸進(jìn)展為心室收縮功能障礙，最終發(fā)展為終末期心力衰竭[1-2]。然而，目前DCM具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。有多項研究表明可能與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)激活、心肌纖維化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等相關(guān)[3]。在DCM的病理生理過程中，RAAS系統(tǒng)過度激活有重要作用，可加重心肌纖維化、心肌細(xì)胞異常凋亡[4]，臨床常以此作為治療靶點。目前臨床上廣泛使用的治療藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)/血管緊張素受體Ⅱ抑制劑(angiotensin Ⅱ receptor antagonist, ARB)，纈沙坦便是其中重要代表藥物之一。盡管如此，DCM的死亡率仍未得到明顯降低，預(yù)后極差[5-6]。

沙庫巴曲纈沙坦(sacubitril valsartan sodium, 又名LCZ696)是由抑制腦啡肽酶與血管緊張素受體組成的復(fù)合制劑，是首個血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑(angiotensin receptor neprilysin inhibitor, ARNi)，其在抗心力衰竭、保護(hù)心臟功能過程中的作用已得到證實[7]；在射血分?jǐn)?shù)下降、射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭中均起到有益作用，而且可以降低住院風(fēng)險、心血管死亡風(fēng)險[7-8]；還有研究證實其對心肌肥厚、心肌纖維化起到保護(hù)作用[9]。因此，通過研究LCZ696對DCM大鼠心肌是否有保護(hù)作用，從而為DCM的防治提供一些新的治療方向。本研究通過建立DCM大鼠心力衰竭模型，觀察LCZ696對DCM大鼠TGF-β1/Smads、Bcl-2/caspase-3、Fas/FasL及降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)等的影響，進(jìn)一步探討其對心臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑健康雄性SD大鼠40只，約150 g/只，SPF級8周齡，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。所有操作均遵循西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物的操作規(guī)范，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食及飲水；高糖高脂飼料(配方為10%豬油、20%蔗糖、6%蛋白粉、61%常規(guī)飼料)由成都達(dá)碩飼料公司提供，許可證編號蘇飼審(2009)05032；鏈脲佐菌素(STZ，S0130)購自美國Sigma公司，TGF-β1、Smad7、caspase-3、Bcl-2、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、Fas/FasL抗體均購于恒意賽，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由Roche公司提供。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合動物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 模型建立及實驗分組采用高糖高脂飲食聯(lián)合腹腔注射STZ法制備糖尿病模型后，以普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，分別在第4周、第6周、第8周處死2只大鼠，觀察心肌結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在第8周時大鼠的心肌結(jié)構(gòu)改變，視為DCM造模成功。將大鼠隨機(jī)分為4組(n=5)。control+alcohol組、DCM+alcohol組予以等量等濃度乙醇溶劑灌胃，DCM+VST組予以纈沙坦+乙醇溶劑30 mg/(kg·d)，DCM+SVST組予以LCZ696+乙醇溶劑60 mg/(kg·d)，持續(xù)8周(按照SUEMATSU等[10]實驗中所應(yīng)用劑量)。

1.3 心臟超聲評估心臟結(jié)構(gòu)及功能變化實驗干預(yù)結(jié)束后常規(guī)稱量體質(zhì)量，使用30 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉后采用超聲檢測儀檢測。采用彩色多普勒超聲顯像儀(GE Vivid E9)，探頭頻率3.5 MHz，主要記錄的參數(shù)包括舒張期左心室內(nèi)徑(LVIDd)、收縮期左心室內(nèi)徑(LVIDs)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、短軸縮短率(LVFS)等值。

1.4 HE及Masson染色觀察心肌病理組織學(xué)變化心臟彩超檢查結(jié)束后隨即處死大鼠，解剖大鼠并快速取出心臟，反復(fù)清洗并分離心室肌，常規(guī)固定并制作石蠟切片，HE染色及Masson染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡各組石蠟切片按照TUNEL試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，并滴加抗熒光猝滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察計算凋亡的心肌細(xì)胞，綠色熒光細(xì)胞核為陽性結(jié)果。

1.6 免疫組化檢測心肌TGF-β1、Smad7、CGRP蛋白的表達(dá)各組石蠟切片常規(guī)脫蠟處理，用30 mL/L過氧化氫阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，封閉，加一抗(TGF-β1、Smad7、CGRP)，4 ℃冰箱過夜，次日滴加二抗孵育，洗片， 顯色，蘇木素復(fù)染10 s，脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微下觀察，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件計算各組平均吸光度(A)值。

1.7 Western blotting檢測心肌Bcl-2、caspase-3、Fas/FasL蛋白表達(dá)取心肌組織適量，使用細(xì)胞裂解液提取蛋白，使用BCA法檢測蛋白濃度。樣品蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至PDVF膜，封閉2 h。滴加一抗(Bcl-2、Fas的稀釋濃度為 1∶500，caspase-3、FasL的稀釋濃度為 1∶1 000)，4 ℃過夜，次日滴加二抗(1∶10 000)，孵育后洗膜。顯色、曝光，保存膠片。使用image J軟件分析目的條帶灰度值，使用GAPDH條帶進(jìn)行灰度值校正。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心臟彩超結(jié)果及比較與control+alcohol組相比，DCM+alcohol組大鼠的LVEF、LVFS下降(P<0.05)；與DCM+alcohol組相比，DCM+VST組、DCM+SVST組的LVEF、LVFS均升高(P<0.05)，但以DCM+SVST組升高更為明顯(P<0.05，圖1、表1)。

圖1 各組大鼠心臟彩超的檢測結(jié)果

表1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果的比較Tab.1 Comparison of ultrasonic cardiogram results among different rat heart groups (n=5,

2.2 各組大鼠心肌組織的病理學(xué)改變control+alcohol組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核大小均一；DCM+alcohol組心肌纖維排列紊亂、稀疏，心肌細(xì)胞肥大變性，細(xì)胞核大小不一，心肌間藍(lán)染的膠原纖維增加；與DCM+alcohol組相比，DCM+VST組、DCM+SVST組心肌細(xì)胞肥大及膠原排列紊亂得到改善，心肌間藍(lán)染的膠原纖維較少，以DCM+SVST組更為明顯(圖2)。

圖2 各組大鼠心臟組織的病理學(xué)改變

2.3 各組大鼠心肌組織TUNEL染色情況正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光，與control+alcohol組比較，DCM+alcohol組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加(P<0.05)；與DCM+alcohol組比較，DCM+VST組、DCM+SVST組較凋亡細(xì)胞均減少(P<0.05)，以DCM+SVST組減少程度明顯(P<0.05，圖3)。

圖3 各組大鼠心臟組織TUNEL染色結(jié)果及比較

2.4 各組大鼠心肌組織免疫組化染色結(jié)果與control+alcohol組比較，DCM+alcohol組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，Smad7、CGRP蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；與DCM+alcohol組比較，DCM+VST組、DCM+SVST組TGF-β1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Smad7、CGRP蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，以DCM+SVST組變化程度更為明顯(P<0.05，圖4)。

圖4 各組大鼠心臟組織TGF-β1、Smad7、CGRP免疫組化染色結(jié)果

2.5 各組大鼠心肌組織caspase-3、Bcl-2、Fas/FasL蛋白的表達(dá)情況與control+alcohol組比較，DCM+alcohol組大鼠心肌組織Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.05)，caspase-3、Fas/FasL蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與DCM+alcohol組相比，DCM+SVST組、DCM+VST組大鼠心肌組織Bcl-2表達(dá)增加(P<0.05)，caspase-3、Fas/FasL蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，且DCM+SVST組優(yōu)于DCM+VST組(P<0.05，圖5)。

3 討 論

DCM是糖尿病的特異性心肌病變，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種調(diào)控途徑，目前尚未闡述清楚，可能源于高血糖狀態(tài)下各種因素共同影響心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等改變。若能阻斷或改善上述改變，則可能帶來臨床獲益，也是目前研究臨床藥物治療的作用靶點。

LCZ696在抑制血管緊張素Ⅱ的受體1(AT1)的同時，其中性腦啡肽酶抑制劑(enkephalinase inhibitor, NEPi)可以增加內(nèi)源性活性肽，抑制腦啡肽酶活性，減少體內(nèi)生物活性物質(zhì)降解，增加如利鈉肽、CGRP等含量[11]，達(dá)到利尿、擴(kuò)血管作用。其中CGRP是目前已知的最強(qiáng)舒張血管的活性多肽，在保護(hù)心血管系統(tǒng)中有重要意義。有證據(jù)顯示，CGRP可改善心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等病理改變[12]。ARB以其代表藥物纈沙坦為例，大量研究表明，纈沙坦對于DCM有改善心肌纖維化、減少細(xì)胞凋亡等作用。抑制腦啡肽酶活性的同時，抑制RAAS系統(tǒng)或許可以為DCM患者帶來更大的臨床獲益，開創(chuàng)出新的治療手段。LCZ696由約24 mg沙庫巴曲和26 mg纈沙坦組成，約等于以1∶1混合復(fù)合制劑，因此60 mg/kg LCZ696中約等于含有30 mg/kg纈沙坦。本研究旨在證實LCZ696對DCM 心肌纖維化、心肌細(xì)胞異常凋亡等的影響，判斷LCZ696除去同等劑量纈沙坦成分可實現(xiàn)的作用效果外，NEPi組分在DCM中是否對ARB抗心肌纖維化、抗細(xì)胞凋亡產(chǎn)生協(xié)同、增量效應(yīng)，以及發(fā)現(xiàn)可能參與其中的相關(guān)生物活性肽。

本研究針對大鼠功能及病理變化的結(jié)果顯示，與DCM組相比較，DCM+SVST組、DCM+VST 組心臟功能和心肌病理結(jié)構(gòu)得到明顯改善，以LCZ696治療后改善更為明顯，據(jù)此認(rèn)為LCZ696對于DCM治療是有效的，且療效優(yōu)于單獨使用等劑量纈沙坦。

有研究證明，DCM心肌纖維化中的TGF-β1/Smads信號通路有重要作用。在高糖影響下，活化的TGF-β1募集并磷酸化其下游Smad2和Smad3，促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展，而抑制型Smad7通過與Smad2/3競爭性結(jié)合TGF-β1，阻斷Smad2/3的激活，達(dá)到抗纖維化作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，與DCM組大鼠相比較，DCM+SVST組、DCM+VST組均可以下調(diào)TGF-β1表達(dá)，上調(diào)Smad7表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads通路，減輕心肌纖維化，以DCM+SVST組改變更為明顯。

有研究證實，纈沙坦可通過調(diào)控caspase-3、Bcl-2、Fas/FasL改善DCM心肌細(xì)胞凋亡，其中caspase-3被認(rèn)為是凋亡通路下游的關(guān)鍵水解酶，一旦caspase-3被激活，凋亡將不可避免[15]。Bcl-2通過改變核內(nèi)氧化還原平衡，阻止胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，抑制線粒體膜釋放細(xì)胞色素-C，抑制caspase-3蛋白酶的活化，阻斷細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[16]。在本研究中，與DCM組比較，DCM+SVST組、DCM+VST 組Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，caspase-3表達(dá)下調(diào)，且DCM+SVST組改變更為明顯；另外，F(xiàn)as/FasL作為細(xì)胞凋亡信號通路之一，在DCM中，F(xiàn)asL與表達(dá)Fas的靶細(xì)胞交聯(lián)后，啟動凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致Fas表達(dá)陽性的靶細(xì)胞死亡[17]。本研究證明LCZ696可下調(diào)Fas蛋白表達(dá)，抑制Fas/FasL通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少心肌細(xì)胞凋亡，仍以DCM+SVST組下調(diào)明顯。

CGRP對于心臟有強(qiáng)大的保護(hù)作用，有學(xué)者認(rèn)為，CGRP水平下降可能是導(dǎo)致心力衰竭的重要原因之一[18]。在本研究中，與DCM組大鼠相比較，LCZ696與纈沙坦均可上調(diào)大鼠心肌中CGRP表達(dá)，LCZ696作用效果明顯優(yōu)于纈沙坦，表明LCZ696中NEPi可協(xié)同上調(diào)CGRP含量，增強(qiáng)對心肌保護(hù)作用。

綜上所述，LCZ696可改善心肌纖維化、降低心肌細(xì)胞異常凋亡，且LCZ696作用效果優(yōu)于等劑量纈沙坦單獨治療。LCZ696治療DCM優(yōu)于ARB的機(jī)制得益于LCZ696中的NEPi增加了CGRP表達(dá)，以協(xié)同、增加RAAS抑制劑作用，通過調(diào)控TGF-β/samds、Bcl-2、caspase-3、Fas/FasL信號通路保護(hù)心肌，可以為DCM臨床治療提供新的靶點。因此，LCZ696亦有可能成為治療DCM的具有巨大潛力的新型藥物。