吳昌學(xué)，趙 艷，張 婷，張 健，禹文峰，柏 華，張啟芳

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004；2. 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，貴州都勻 558000)

三氧化二砷(As2O3; arsenic trioxide, ATO)能有效抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)，但是對(duì)非APL的急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)抑制效果不明顯[1]，說明AML細(xì)胞對(duì)ATO耐藥，但耐藥機(jī)制不清。

ATO作用細(xì)胞的方式多樣，除了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[2-3]，ATO還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物(reactive oxygen species, ROS)[4-5]。ROS在化療中具有雙面性質(zhì)。大量ROS可以殺死大部分腫瘤細(xì)胞，但是ROS能促使腫瘤細(xì)胞上調(diào)抗氧化基因表達(dá)以消除大量的ROS，以致于個(gè)別腫瘤細(xì)胞幸存，產(chǎn)生耐藥[6-7]。越來越多的證據(jù)表明，AML細(xì)胞中ROS水平高于正常成髓細(xì)胞[8-9]。由于AML細(xì)胞已經(jīng)上調(diào)其抗氧化蛋白以補(bǔ)償ROS的劇增，因此無法耐受額外的ROS，而靶向的谷胱甘肽代謝可以使AML細(xì)胞減少[10]。也有研究報(bào)道，二氯乙酸則可以上調(diào)ATO誘導(dǎo)的ROS增強(qiáng)，從而達(dá)到抑制AML的作用[11]。這些研究說明，抑制AML細(xì)胞抗氧化能力或上調(diào)ROS水平是提高對(duì)AML細(xì)胞抑制能力的有效途徑。

本課題組前期的研究表明，抑制AML細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)活性能夠抑制AML生存、增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[12-13]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，激活乳腺癌細(xì)胞STAT3可以減少ROS，增強(qiáng)放療耐受，而抑制STAT3則可增加ROS，增強(qiáng)放療的敏感性[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，ATO通過聯(lián)合抑制JAK1/JAK2來抑制STAT3活性，增強(qiáng)ROS水平，可有效地抑制淋巴瘤細(xì)胞U937的凋亡[15]。激活STAT3增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥、上調(diào)抗氧化因子Nrf2水平[16]。而Nrf2則有助于AML化療耐受[17]。這說明抑制STAT3活性是抑制細(xì)胞抗氧化能力和增加ROS水平的有效手段。

AML在遺傳上具有高度異質(zhì)性，這導(dǎo)致許多靶向藥物效果不佳[18]。因此，針對(duì)細(xì)胞基本的特性，例如獨(dú)立于任何特定遺傳突變的氧化還原性狀態(tài)似乎是比較合理的策略。基于此，本研究通過觀察STAT3抑制劑Stattic對(duì)ATO誘導(dǎo)AML的THP1細(xì)胞株生存和凋亡的影響，初步探討STAT3抑制劑聯(lián)合ATO對(duì)AML的作用機(jī)制，為臨床選擇ATO聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、抗體和試劑盒Roswell Park Memorial Institute -1640(RPMI-1640)培養(yǎng)液、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品。Stattic購自Selleck；ATO、DCFH-DA購自Sigma(St. Louis, MO, USA)，Trizol購自美國Invitrogen公司；P-Tyr-STAT3、STAT3、Nrf2、β-Tubulin和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國CST公司。CCK-8、Annexin V/PI和qPCR試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)THP1細(xì)胞株購自美國典型培養(yǎng)保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，培養(yǎng)在含100 mL/L澳洲胎牛血清(Gibco)、1×Antibiotic- Antimycotic(Gibco)的RPMI-1640養(yǎng)液(Gibco公司)中，培養(yǎng)條件為含50 mL/L CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。

1.3 Western blotting檢測收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次并離心后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(20 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，200 mL/L glycerol，10 mL/L Triton X-100，1×蛋白酶抑制劑)，冰上孵育20 min, 14 000 r/min離心15 min后取上清(即總蛋白)，用Bradford測量蛋白濃度。在提取的總蛋白中加入上樣緩沖液，混勻后95 ℃煮10 min。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，用含50 g/L脫脂奶粉的TBS溶液按1∶1 000稀釋一抗，將膜放在一抗中室溫孵育2 h。用含50 g/L脫脂奶粉的TBS溶液按1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，將洗好的膜在二抗中室溫孵育1 h。ECL超敏免疫印跡檢測試劑(Amersham公司)檢測蛋白表達(dá)，用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，Image J分析蛋白條帶灰度值。

1.4 CCK-8測定細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種細(xì)胞在96孔板，1×104細(xì)胞/孔。用10 μmol/L Stattic和ATO(1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μmol/L)組合處理THP1細(xì)胞48 h。采用CCK8 Kit檢測細(xì)胞生存能力。按說明書操作，酶標(biāo)儀的吸光度設(shè)定在450 nm處讀取A值。計(jì)算細(xì)胞存活抑制率：細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測用DMSO、ATO或Stattic處理THP1細(xì)胞，終濃度為1.0 nmol/L，在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱孵育48 h，收集細(xì)胞，按說明書Annexin V/PI雙染細(xì)胞凋亡。樣品準(zhǔn)備好后上流式細(xì)胞儀測試，以DMSO組作為空白對(duì)照，數(shù)據(jù)用FlowJo V10軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。Caspase-Glo?3/7法檢測細(xì)胞凋亡。

把160 000個(gè)/μL THP1細(xì)胞100 μL接種于96孔不透明白板，按實(shí)驗(yàn)方案加入DMSO或Stattic或ATO處理6 h。按照Caspase 3/7 Glo(Promega)試劑盒說明書進(jìn)行操作。用藥細(xì)胞處理到達(dá)時(shí)間時(shí)，取出96孔板，平衡至室溫。每孔加入100 μL Caspase-Glo?3/7試劑，混勻，室溫孵育90 min。讀板機(jī)讀取熒光值。不含細(xì)胞的培養(yǎng)基樣品吸收值作為背景值，DMSO處理的細(xì)胞樣品作為陰性對(duì)照。

1.6 ROS檢測收集細(xì)胞離心，棄上清，加入用無血清液體稀釋的10 μmol/L DCFH-DA工作溶液懸浮細(xì)胞，在37 ℃下孵育細(xì)胞30 min。每3～5 min反轉(zhuǎn)1次混合物，使探針和細(xì)胞完全接觸。隨后用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光(525 nmol/L)，用FlowJo V8軟件(Treestar)分析數(shù)據(jù)。

1.7 Real-time PCR檢測將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔板中，分別加入2 μmol/L ATO或10 μmol/L Stattic，DMSO作為對(duì)照組，培養(yǎng)48 h。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定RNA樣品吸光度比值，取1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測目的基因的mRNA表達(dá)。GCLC上游引物5′-TTGAGGCCAACATGCGAAA-3′，下游引物5′-AGGACAGCCTAATCTGGGAAATG-3′；GCLM上游引物5′-GGCACAGGTAAAACCAAA-TAGTAAC-3′，下游引物5′-CAAATTGTTTAGCAAATGCAGTCA-3′；HO-1上游引物5′-ATGGCCTCCCTGTACCACATC-3′，下游引物5′-TGTTGCGCTCAATCTCCTCCT-3′。內(nèi)參β-actin引物為：上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAA-G-3′，下游5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。采集待測目的基因和內(nèi)參(β-actin)的Ct值，計(jì)算ΔΔCt及相對(duì)表達(dá)量(RQ)，RQ=2-平均ΔΔCt。

1.8 生物信息分析HO-1表達(dá)用Online軟件GEPIA Ⅱ分析the cancer genome atlas(TCGA)AML數(shù)據(jù)庫患者HO-1 mRNA 表達(dá)水平(Gene Expression Profiling Interactive Analysis Ⅱ, http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)，分析參數(shù)設(shè)置：Log2FC cutoff is 1,P-value cutoff is 0.01[19]。

2 結(jié) 果

2.1 Stattic增強(qiáng)ATO對(duì)THP1細(xì)胞的生存抑制用10 μmol/L Stattic處理THP1細(xì)胞6 h，與預(yù)期一致，Western blotting結(jié)果顯示Stattic顯著地抑制P-STAT3活性(P<0.001，圖1A)。與ATO單獨(dú)處理相比，在ATO為2.5 μmol/L時(shí)與Stattic的聯(lián)合就顯著地增強(qiáng)ATO介導(dǎo)的細(xì)胞生存抑制(圖1B)。

圖1 Stattic增強(qiáng)ATO對(duì)THP1的生存抑制

2.2 Stattic增強(qiáng)ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為了檢測Stattic對(duì)ATO誘導(dǎo)的凋亡影響，本研究聯(lián)合2 μmol/L ATO與10 μmol/L Stattic處理THP1細(xì)胞：用ATO處理THP1細(xì)胞48 h時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示ATO誘導(dǎo)21.2%的細(xì)胞凋亡，聯(lián)合Stattic可誘導(dǎo)33.4%的細(xì)胞凋亡(圖2A)。同樣，Stattic聯(lián)合ATO也顯著增強(qiáng)Caspase 3/7的活性(圖2B)。

2.3 Stattic對(duì)ATO介導(dǎo)的ROS水平影響 用2 μmol/L ATO或10 μmol/L Stattic處理THP1細(xì)胞6 h，收集細(xì)胞，用DCFH-DA工作溶液染色細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度(525 nmol/L)，Stattic對(duì)ATO-介導(dǎo)的ROS影響。結(jié)果顯示，ATO顯著誘導(dǎo)ROS水平升高，Stattic具有促進(jìn)ATO誘導(dǎo)ROS水平升高的作用(圖3)。

圖2 Stattic加劇了ATO誘導(dǎo)的THP1細(xì)胞凋亡

圖3 Stattic增強(qiáng)ATO誘導(dǎo)的ROS水平

2.4 Stattic對(duì)As2O3介導(dǎo)的Nrf2表達(dá)的影響用2 μmol/L ATO或10 μmol/L Stattic單一或組合處理THP1細(xì)胞6 h，用β-Tubulin作為內(nèi)參照，Western blotting檢測Nrf2表達(dá)水平，結(jié)果顯示，ATO顯著上調(diào)Nrf2表達(dá)(P<0.001)，而Stattic明顯降低ATO誘導(dǎo)的Nrf2的表達(dá)(P<0.001，圖4)。

圖4 Stattic抑制ATO上調(diào)的Nrf2表達(dá)

2.5 Stattic對(duì)Nrf2下游基因表達(dá)的影響qPCR檢測結(jié)果顯示，ATO顯著誘導(dǎo)Nrf2部分下游基因GCLC、GCLM和HO-1的mRNA表達(dá)，而Stattic明顯抑制ATO上調(diào)的這些基因表達(dá)(圖5)。Online軟件GEPIA Ⅱ分析TCGA數(shù)據(jù)庫AML患者HO-1的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示HO-1在AML患者中異常高表達(dá)。

圖5 qPCR檢測ATO和Stattic對(duì)GCLC、GCLM和HO-1 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

AML是遺傳學(xué)上具有高度異質(zhì)性的髓系惡性腫瘤。有研究報(bào)道，ATO3抑制APL效果顯著，但AML細(xì)胞對(duì)ATO有抗性，機(jī)制不清。本研究結(jié)果顯示，ATO誘導(dǎo)的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)增強(qiáng)了AML細(xì)胞耐藥性，聯(lián)合STAT3抑制劑Stattic能夠有效抑制ATO上調(diào)Nrf2表達(dá)，增加ATO誘導(dǎo)的ROS水平，從而增強(qiáng)ATP介導(dǎo)的THP1細(xì)胞生存抑制、細(xì)胞凋亡。表明ATO聯(lián)合抑制STAT3活性具有協(xié)同抑制AML細(xì)胞作用。

本研究結(jié)果顯示，ATO不僅誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，而且也上調(diào)了Nrf2/HO-1表達(dá), 這也可能是AML細(xì)胞對(duì)ATO產(chǎn)生耐藥的原因之一，該發(fā)現(xiàn)支持Nrf2增強(qiáng)AML細(xì)胞耐藥性的文獻(xiàn)報(bào)道[18]。本研究還采用STAT3抑制劑Stattic聯(lián)合ATO處理THP1細(xì)胞，研究STAT3調(diào)控Nrf2表達(dá)和ROS水平的作用，結(jié)果顯示，Stattic增強(qiáng)了ATO對(duì)THP1細(xì)胞的生存抑制、加劇ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。提示ATO聯(lián)合Stattic增強(qiáng)了ATO誘導(dǎo)的ROS。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過抑制谷胱甘肽可增加ROS消除AML細(xì)胞[10]，而二氯乙酸可增強(qiáng)ATO誘導(dǎo)的ROS，上調(diào)ATO抑制AML的效果[11]，蘆可替尼(Ruxolitinib)通過抑制JAK1/2來抑制STAT3活性，上調(diào)ROS增強(qiáng)ATO誘導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞U937 增殖和凋亡[15]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證上述的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果。

為了探討Stattic對(duì)ATO藥物增效的分子機(jī)制，本研究檢測Stattic對(duì)STAT3活性、Nrf2/HO-1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，Stattic不僅能顯著地抑制STAT3活性，還能抑制Nrf2/HO-1的表達(dá)。這也與文獻(xiàn)報(bào)道STAT3活性上調(diào)Nrf2表達(dá)類似[16]。為了進(jìn)一步證明Nrf2表達(dá)被下調(diào)，本研究更進(jìn)一步檢測了Stattic對(duì)Nrf2的一些下游基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GCLM和GCLC均被抑制，提示Stattic也可抑制Nrf2/HO-1通路。有文獻(xiàn)報(bào)道與本研究結(jié)果不一致，雖然Stattic通過抑制STAT3活性誘導(dǎo)THP1細(xì)胞凋亡，但是也上調(diào)ERK活性[19]。ERK活性的上調(diào)支持AML細(xì)胞存活[20]。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3活性可以抑制AML生存并誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡[21]。此外，STAT3是重要的免疫檢查點(diǎn)之一。研究組前期工作用CpG-Stat3 siRNA沉默STAT3表達(dá)，不僅誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡，還增強(qiáng)了STAT3介導(dǎo)的免疫抑制，提高了AML小鼠免疫細(xì)胞功能，有效抑制AML細(xì)胞生長[21]，還能降低人原代AML細(xì)胞的免疫抑制作用[22]。本研究結(jié)果也顯示，Stattic不僅通過ATO抑制STAT3，而且抑制了ATO上調(diào)的Nrf2表達(dá)，顯著地降低AML對(duì)ATO的抗性。鑒于STAT3高表達(dá)抑制抗癌免疫細(xì)胞功能、增強(qiáng)免疫抑制細(xì)胞功能，ATO聯(lián)合Stattic有望成為抑制AML細(xì)胞生存、增強(qiáng)AML細(xì)胞免疫原性、提高AML患者免疫功能的組合。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Stattic可增強(qiáng)ATO對(duì)AML細(xì)胞生存抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，其機(jī)制可能與抑制Nrf2 和Nrf2下游基因表達(dá)引起的ROS增多有關(guān)。但本研究有2個(gè)局限：只在1個(gè)AML細(xì)胞株上完成；沒有在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證。這在下一步的研究中將進(jìn)行補(bǔ)充。