李 瀟，劉 欣，宋亞華，趙菊輝，陳芬榮，趙 剛，王 燕，李 晗，史海濤

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省胃腸動(dòng)力疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心，陜西西安 710004)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是發(fā)生在直腸與結(jié)腸的可能與自身免疫有關(guān)的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。目前的研究表明其與免疫失調(diào)、腸道菌群及環(huán)境因素等有關(guān)[1]。臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及黏液膿血便，其慢性進(jìn)展、易復(fù)發(fā)，且發(fā)病率逐年上升，目前尚無(wú)根治方法[2]。因此，提供新的IBD的診療防治策略顯得尤為重要。

炎性小體是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其功能主要是識(shí)別不同的損傷信號(hào)。NLRPs是炎癥小體的關(guān)鍵組成部分[3]。NLRP蛋白家族包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP10等。目前研究最多的是NLRP3炎性小體，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)及caspase-1組成，其在炎癥、纖維化、腫瘤等發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4-5]，可作為炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞。NLRP3炎性小體的激活因素包括低密度脂蛋白、高血糖、膽固醇結(jié)晶、尿酸、游離脂肪酸等，其激活后可促進(jìn)IL-1β、IL-18等炎性因子的成熟和分泌，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及組織損傷[6-9]。NLRP1炎性小體與NLRP3炎性小體作用類似，其活化后可促進(jìn)IL-1β、IL-18、IL-33等炎癥因子的成熟和釋放。研究表明，NLRP1基因中rs2175827、rs11656977和rs12150220基因與IBD的發(fā)病密切相關(guān)[10]。但未見(jiàn)有關(guān)NLRP1在IBD尤其是UC中的研究報(bào)道。有關(guān)NLRP3在IBD中的研究結(jié)果尚不一致。有研究顯示，患有急性或慢性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中存在NLRP3的高表達(dá)。BAUER等[11]研究發(fā)現(xiàn)，用葡聚糖硫酸鈉(DSS)造模誘導(dǎo)正常小鼠與NLRP3缺失小鼠結(jié)腸炎，觀察發(fā)現(xiàn)NLRP3缺失小鼠的腸道損傷較正常小鼠嚴(yán)重程度明顯下降，提示NLRP3可能作為炎癥反應(yīng)指標(biāo)或促炎癥發(fā)生介質(zhì)存在；但ALLEN[12]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NLRP3的缺失可使DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的腸黏膜損傷加重，又提示NLPR3可作為一個(gè)保護(hù)性因子存在。本實(shí)驗(yàn)旨在明確UC患者結(jié)腸組織中NLRP1、NLRP3的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與UC病情嚴(yán)重程度、內(nèi)鏡評(píng)分及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性，為UC病情嚴(yán)重程度、療效的評(píng)判以及探索新的治療靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2018年6月-2019年4月進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的UC患者46例。UC入組標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過(guò)知情同意；②參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2018年，北京)》，經(jīng)臨床、影像、內(nèi)鏡、實(shí)驗(yàn)室檢查及病理組織學(xué)檢查等診斷手段，符合UC。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重并發(fā)癥，如腸梗阻、局部狹窄、腸穿孔、中毒性巨結(jié)腸等；②有癌變可能者；③合并有神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)等嚴(yán)重的原發(fā)性疾病者；④合并有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病者；⑤哺乳或妊娠期婦女；⑥嚴(yán)重認(rèn)知障礙、精神病和終末期患者；⑦病情危重?zé)o法耐受活檢檢查者。

采用改良Mayo評(píng)分系統(tǒng)對(duì)UC活動(dòng)度進(jìn)行判定，即輕度活動(dòng)(≤5分)及中重度活動(dòng)(≥6分)，本組UC組患者輕度22例，男14例，女8例，平均年齡(43.1±3.3)歲；中重度24例，男11例，女13例，平均年齡(46.3±2.8)歲。同時(shí)選取20例健康對(duì)照者作為對(duì)照組，其中男10例，女10例，平均年齡(49.7±3.3)歲，各組在性別及年齡上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有UC患者在服用聚乙二醇電解質(zhì)散行腸道清潔準(zhǔn)備并簽署知情同意。Mayo評(píng)分系統(tǒng)Mayo內(nèi)鏡評(píng)分參考《炎癥性腸病診斷與治療共識(shí)(2018年，北京)》。UC腸鏡下病變范圍亦參考《炎癥性腸病診斷與治療共識(shí)(2018年，北京)》，采用蒙特利爾分型，分為直腸組(11例)、左半結(jié)腸組(23例)及全結(jié)腸組(12例)。

1.2 主要試劑及器材兔抗人NLRP3-DF7438多克隆抗體購(gòu)自Affinity抗體公司，兔抗人NLRP1多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司，伊紅染色液、蘇木精染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，RNAfast1000試劑盒購(gòu)自陜西先鋒生物公司，K1622逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Ferments Themo，Real-time PCR Master Mix試劑購(gòu)自陜西先鋒生物公司。采用Beacondesigner 4.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物合成由北京奧科生物科技有限公司進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量PCR儀(型號(hào)TL988)購(gòu)自Tianglong(天隆生物，中國(guó))。

1.3 免疫組化法檢測(cè)NLRP1及NLRP3表達(dá)UC組和正常對(duì)照組的結(jié)腸黏膜組織標(biāo)本經(jīng)40 g/L的多聚甲醛固定后，脫水、透明、石蠟包埋連續(xù)切片，HE染色證實(shí)組織結(jié)構(gòu)及病變程度。嚴(yán)格按操作說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色：常規(guī)脫蠟至水，置于0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS(pH 7.4)洗滌5 min×3次。30 mL/L H2O2避光孵育20 min滅活內(nèi)源性酶，PBS洗滌5 min×3次。NLRP3(1∶100)及NLRP1(1∶100)一抗工作液4 ℃過(guò)夜，自然復(fù)溫后PBS洗滌5 min×3次。滴加二抗室溫孵育40 min，PBS洗滌5 min×3次。DAB室溫顯色、蘇木素輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化，逐級(jí)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件，分析測(cè)定積分吸光度(integrated optical density, IA)值，以其平均值代表蛋白表達(dá)水平。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)NLRP1及NLRP3 mRNA表達(dá)按照RNAfast 1000試劑盒、K1622試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取組織mRNA及合成cDNA，PCR反應(yīng)按照Real-time PCR Master Mix試劑說(shuō)明書(shū)，NLRP1上游5′-TCTGAGTGATGAGATGAG-3′，下游5′-GTGAGGATGTGCTATTAC-3′；NLRP3上游5′-CTCGGTGACTTCGGAATC-3′，下游5′-ATGGC-TGGTGCTCAATAC-3′；β-actin上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游5′-AGGA-AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。反應(yīng)總體積為20 μL：SYBR?Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，上游、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板(cDNA)1 μL，雙蒸水8 μL。以β-Action為內(nèi)參。計(jì)算2-ΔΔCT獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中CT(cycle threshold)表示循環(huán)閾值。

1.5 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)采用血液細(xì)胞分析儀、生化分析儀檢測(cè)血小板、血尿酸、低密度脂蛋白膽固醇、膽固醇、C-反應(yīng)蛋白、血沉水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD；當(dāng)數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時(shí)，配對(duì)兩組間的比較采用Wilcoxon秩檢驗(yàn)，多組間的比較采用Kruskal—wal1is H秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料間比較采用卡方檢驗(yàn)，兩組計(jì)量資料間的相關(guān)性分析根據(jù)是否符合正態(tài)分布選用Person或Spearman相關(guān)分析的一種。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常對(duì)照組及UC組結(jié)腸黏膜組織的HE染色顯微鏡下見(jiàn)對(duì)照組結(jié)腸黏膜完整，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞連續(xù)，未見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。UC組結(jié)腸黏膜可見(jiàn)上皮破壞，腺體破壞，固有層可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見(jiàn)隱窩膿腫、隱窩破壞及分支狀隱窩，黏膜層及黏膜下層出現(xiàn)血管擴(kuò)張(圖1)。

圖1 正常對(duì)照組及UC組結(jié)腸黏膜組織的HE染色

2.2 NLRP1和NLRP3的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，NLRP1和NLRP3在UC組和對(duì)照組結(jié)腸黏膜組織中均有表達(dá)(圖2)，主要表達(dá)在胞質(zhì)和胞膜，呈彌漫性分布。與正常對(duì)照組相比，輕度UC及中重度UC患者的NLRP1及NLRP3均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與輕度UC相比，中重度UC患者的結(jié)腸黏膜組織中NLRP1明顯升高(P<0.05)，而NLPR3無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

圖2 免疫組化法檢測(cè)正常對(duì)照組及UC組結(jié)腸黏膜組織NLRP1、NLRP3表達(dá)

表1 正常對(duì)照組及UC組結(jié)腸黏膜組織中NLRP1與NLRP3蛋白表達(dá)的比較Tab.1 Protein expression levels of NLRP1 and NLRP3 in colonic mucosal tissues of normal control group and UC group

腸鏡下不同病變范圍(直腸、左半結(jié)腸、全結(jié)腸)的UC患者的結(jié)腸黏膜組織中NLRP1及NLRP3表達(dá)無(wú)明顯差異(表2)。Real-time PCR結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，與正常對(duì)照組相比，輕度UC及中重度UC患者的結(jié)腸黏膜組織中NLRP1 mRNA及NLRP3 mRNA均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與輕度UC相比，中重度UC患者的結(jié)腸黏膜組織中NLRP1 mRNA明顯升高(P<0.05)，而NLPR3 mRNA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

表2 不同病變范圍下結(jié)腸黏膜組織中NLRP1與NLRP3的蛋白表達(dá)的比較Tab.2 Protein expressions of NLRP1 and NLRP3 in different colonic lesion ranges

圖3 UC患者結(jié)腸黏膜組織中NLRP1與NLRP3 mRNA表達(dá)的比較

2.3 NLRP1和NLRP3的表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析與輕度UC組相比，中重度UC組Mayo總體評(píng)分、腸鏡評(píng)分、血沉、C反應(yīng)蛋白水平均明顯增加(P<0.05，表3)。UC患者結(jié)腸黏膜組織中NLRP1的表達(dá)與Mayo總體評(píng)分、內(nèi)鏡評(píng)分、血沉、C反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)(P<0.05)；而NLRP3的表達(dá)與C反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)(P<0.05)，但與Mayo總體評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分、血沉變化無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表4)。

2.4 NLRP1和NLRP3的表達(dá)與激活因素的相關(guān)性分析與輕度UC組相比，中重度UC組血小板明顯增加(P<0.05)，而血尿酸、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表5)。UC患者結(jié)腸黏膜組織中NLRP1的表達(dá)與低密度脂蛋白、膽固醇、血小板呈正相關(guān)(P<0.05)，與血尿酸、膽固醇不呈相關(guān)性(P>0.05)；UC患者結(jié)腸黏膜組織中NLRP3的表達(dá)與血尿酸、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇均呈正相關(guān)(P<0.05)，與血小板不具有相關(guān)性(P>0.05，表6)。

表3 不同程度UC患者臨床指標(biāo)的比較Tab.3 Comparison of clinical indicators of UC patients

表4 UC患者結(jié)腸黏膜組織中NLRP1、NLRP3表達(dá)與Mayo總體評(píng)分、內(nèi)鏡評(píng)分、血沉、C反應(yīng)蛋白的相關(guān)性Tab.4 Correlation of NLRP1 and NLRP3 expressions with Mayo overall score, endoscopic score, erythrocyte sedimentation rate, and C-reactive protein in colonic mucosal tissues of UC patients

表5 不同程度UC患者臨床生化指標(biāo)的比較Tab.5 Comparison of clinical indicators of UC patients

表6 UC患者結(jié)腸黏膜組織中NLRP1、NLRP3表達(dá)與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性Tab.6 Correlation of NLRP1 and NLRP3 expressions with uric acid, cholesterol, low-density lipoprotein and platelet in colonic mucosal tissues of UC patients

3 討 論

炎癥小體可誘導(dǎo)caspase-1的自我剪切，caspase-1能夠調(diào)控IL-1β、IL-18的產(chǎn)生，調(diào)控機(jī)體的自身免疫應(yīng)答反應(yīng)。NLRP3炎癥小體是目前研究最多的炎癥小體，主要存在于中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[11,13]，由NLRP3、ASC和caspase-1結(jié)合而成。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3對(duì)IBD的調(diào)控具有雙向調(diào)節(jié)作用[14]。敲除小鼠NLRP3基因后，給予其口服30 g/L DSS和2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)后出現(xiàn)腸上皮完整性破壞、死亡率增加。該研究還發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體可通過(guò)增加IL-18分泌，以抑制由DSS所誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)生。以上研究均提示NLRP3炎癥小體對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎有保護(hù)作用。但同時(shí)也有相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，NLRP3基因敲除小鼠對(duì)口服20 g/L DSS所誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)生率明顯下降，DSS可致溶酶體破壞，并可通過(guò)向胞質(zhì)釋放其內(nèi)容物而激活NLRP3炎癥小體，致caspase-1活化和IL-1β釋放，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生。還有研究顯示，使用NLRP3依賴的pro-caspase-1、IL-1β和IL-18的抑制劑治療，能夠減輕小鼠急性結(jié)腸炎。此外，還發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體對(duì)TNF-α、TGF-β、腸道菌群等均有影響[1]，而這些因素的變化均可影響結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。由此可見(jiàn)，NLRP3參與結(jié)腸炎的機(jī)制十分復(fù)雜，但具體的作用機(jī)制及如何利用其指導(dǎo)臨床實(shí)踐仍需進(jìn)一步研究。NLRP1廣泛存在于T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中。NLRP1炎性小體的過(guò)度激活是腸炎的一個(gè)重要原因[10]，但其在IBD中的具體作用尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，NLRP1與NLRP3在UC患者結(jié)腸組織中的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，且隨著疾病活動(dòng)度的增加，表達(dá)增加，提示其可能在UC發(fā)病中發(fā)揮作用，也可能作為病情嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。相關(guān)性分析表明，NLRP1與Mayo總體評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分均具有相關(guān)性，評(píng)分越高，NLRP1表達(dá)越高，而NLRP3與Mayo總體評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分無(wú)相關(guān)性，提示NLRP1可能還可作為病情嚴(yán)重程度及組織炎癥程度判斷的指標(biāo)，有望用來(lái)評(píng)估黏膜愈合。血沉、C反應(yīng)蛋白是臨床中常用的反映UC炎癥活動(dòng)及嚴(yán)重程度的指標(biāo)，本研究也證實(shí)中重度UC組血沉、C反應(yīng)蛋白均較輕度UC明顯增加，且與Mayo總體評(píng)分、Mayo內(nèi)鏡評(píng)分均具有明顯相關(guān)性。進(jìn)一步分析，NLRP1與血沉及C反應(yīng)蛋白均具有相關(guān)性，NLRP3與C反應(yīng)蛋白具有相關(guān)性，而與血沉不具有相關(guān)性。提示在反映UC嚴(yán)重程度及炎癥活動(dòng)度中，NLRP1及NLRP3與血沉、C反應(yīng)蛋白具有一致性。

在炎癥疾病中，NLRP1的激活因素有很多，其中包括胞壁酰二肽、寄生蟲(chóng)以及炭疽芽孢桿菌的致死毒素等。NLRP3的激活因素既有細(xì)菌、病毒、真菌等微生物及其產(chǎn)物，也可以是ATP、膽固醇、尿酸單鈉等分子[1]。激活機(jī)制主要有胞內(nèi)鉀離子外流、微生物毒素、活性氧、結(jié)晶或微粒物質(zhì)等激活劑等[8]。研究表明，尿酸可以激活NLRP3引起炎癥，且尿酸和UC具有相關(guān)性；膽固醇、低密度脂蛋白可以激活NLRP3引起炎癥，低密度脂蛋白也可以激活NLRP1引起炎癥；此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，在UC的發(fā)病進(jìn)展中，血小板明顯活化，與鉀通道及NLRP3炎癥小體活化有關(guān)[14-15]。本研究提示NLRP1與低密度脂蛋白、血小板具有相關(guān)性(P<0.05)，NLRP3與尿酸、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇均具有相關(guān)性，提示在UC發(fā)病中，NLRP1的激活可能與血小板活化、低密度脂蛋白膽固醇有關(guān)，而NLRP3的激活可能與尿酸、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，NLRP1及NLRP3在UC患者結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)明顯升高，且與Mayo總體評(píng)分、內(nèi)鏡評(píng)分、血沉及C反應(yīng)蛋白均具有相關(guān)性，NLRP1的激活可能與血小板活化、低密度脂蛋白膽固醇有關(guān)，NLRP3的激活可能與血尿酸、膽固醇、低密度脂蛋白有關(guān)。以上結(jié)果提示，NLRP1及NLRP3在UC發(fā)病中可能具有重要作用，同時(shí)可能作為評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度、判斷疾病恢復(fù)的重要指標(biāo)。但其在發(fā)病中具體的作用機(jī)制以及是否可作為黏膜愈合甚至組織愈合的指標(biāo)，仍需擴(kuò)大樣本量及后續(xù)進(jìn)一步研究。