王波濤，趙 琳，夏 翠，祝 康，高天喜，喻 超，孫 斌

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉科，陜西西安 710004)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)起源于鼻咽的上皮，常見(jiàn)局部浸潤(rùn)和早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其病因包括Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染、遺傳易感性和環(huán)境因素[1]。由于NPC的位置較深且早期缺乏明顯的臨床癥狀，因此很難及早發(fā)現(xiàn)。同步化療和放療雖然是晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法且存在有效性[2]，但會(huì)在一些患者中發(fā)生持續(xù)性或復(fù)發(fā)性疾病形式的局部或區(qū)域性衰竭。因此，NPC患者迫切需要新的生物標(biāo)志物和改善治療結(jié)果的治療策略。

BMAL1(brain and muscle arnt-like protein-1, BMAL1)和CLOCK(circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK)是與Period(Per1和Per2)和Cryptochrome(Cry1和Cry2)基因啟動(dòng)子結(jié)合的兩個(gè)主要元件[3]。BMAL1在維持生物體的正常生命活動(dòng)中有重要作用[4]。除了控制生物節(jié)律的功能外，BMAL1還在衰老、心血管疾病、自身免疫性疾病和癌癥中發(fā)揮重要作用[5]。BMAL1參與細(xì)胞周期和增殖的調(diào)節(jié)，其可能在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用[6]。ELSHAZLEY等[7]發(fā)現(xiàn)，惡性胸膜間皮瘤中BMAL1表達(dá)增加，沉默BMAL1后細(xì)胞周期紊亂且細(xì)胞凋亡增加，表明BMAL1可能在癌癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。本研究通過(guò)探究NPC組織中BMAL1蛋白及CerB-2基因的表達(dá)，將為NPC的機(jī)制研究和分子診斷以及患者的預(yù)后和靶向治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株本研究中使用的細(xì)胞系為CNE1，即具有高分化的人NPC細(xì)胞，購(gòu)于上海醫(yī)學(xué)研究院。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和檢測(cè)CNE1細(xì)胞在37 ℃、50 mL/L的CO2環(huán)境中培養(yǎng)，然后使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Auckland, New Zealand)通過(guò)對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。本研究分為對(duì)照組(CK組)和BMAL1、CerB-2轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞系組(NPC組)，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3～5次(符合統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn))。兔抗BMAL1、抗CerB-2抗體購(gòu)自Abcam(Abcam，Cambridge, MA, USA)。MTT用于測(cè)定評(píng)估細(xì)胞的增殖，用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒轉(zhuǎn)染T47D或ZR-75-30細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，接種于96孔板中，每孔含1 000～2 000個(gè)細(xì)胞，用商業(yè)試劑盒(KeyGen)進(jìn)行MTT測(cè)定，并在490 nm處讀取樣品的吸光值。

1.3 細(xì)胞總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用RNAiso Reagent(TaKaRa)從細(xì)胞中分離提取總RNA，用oligo(dT)引物和逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄總RNA(3 μg)。使用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增單鏈cDNA，具體序列如下。BMAL1：5′-CCACCGACTACCAGGAAAGT-3′(正向)和5′-CGCTAAAGTCACAGGGACCA-3′(反向)；CerB-2：5′-TACTGTGCCTTTGAGTCCG-3′(正向)和5′-TTGTCGGCGATAAGGAAG-3′(反向)；GAPDH：5′-GGGTTGAACCATGAGAAGT-3′(正向)和5′-GACTGTGGTCATGAGTCCT-3′(反向)。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。RT-PCR結(jié)果用ABI Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)和SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)測(cè)定相對(duì)mRNA水平，GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCT方法測(cè)定靶基因的mRNA表達(dá)。

1.4 蛋白免疫印跡用環(huán)己酰亞胺(CHX，Biosharp, 10 μmol/L)、MG132(Sigma-Aldrich,10 μmol/L)和BafA1(Sigma-Aldrich, 10 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞，并采用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。通過(guò)80 g/L或100 g/L SDS-PAGE分離細(xì)胞裂解物，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)，封閉，并在不同的一抗(包括特異性抗體)中孵育。將膜在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的二抗(Santa Cruz Biotechnology)中孵育，使用ECL檢測(cè)試劑盒(Perkin Elmer Life Science)將蛋白質(zhì)條帶可視化。

2 結(jié) 果

2.1 BMAL1和CerbB-2對(duì)鼻咽癌CEN1細(xì)胞增殖的影響在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMAL1后(圖1C)，與未轉(zhuǎn)染BMAL1的CNE1細(xì)胞系(圖1A)相比，細(xì)胞增殖數(shù)目明顯增加；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CerbB-2的細(xì)胞系(圖1D)與未轉(zhuǎn)染CerbB-2的CEN1細(xì)胞系(圖1B)相比，細(xì)胞增殖數(shù)目有明顯提高。提示BMAL1和CerbB-2可影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖；BMAL1和CerbB-2可能通過(guò)調(diào)節(jié)某些癌細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路以促進(jìn)或抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移。

圖1 BMAL1和CerbB-2對(duì)鼻咽癌CEN1細(xì)胞增殖的影響

2.2 BMAL1和CerbB-2基因在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果顯示，BMAL1基因在NPC組中表達(dá)水平明顯下調(diào)，而CerbB-2基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，其中BMAL1基因的表達(dá)量在NPC組中比CK組下調(diào)了約71.88%(圖2B)，而CerbB-2在NPC組中的表達(dá)量相較CK組上調(diào)了約66.42%(圖2C)。提示BMAL1基因和CerbB-2基因在CNE1細(xì)胞中共同調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖(圖2)。

圖2 BMAL1和CerbB-2在鼻咽癌CEN1細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 BMAL1和CerbB-2蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)為了驗(yàn)證BMAL1和CerbB-2基因表達(dá)的準(zhǔn)確性，本研究檢測(cè)了BMAL1和CerbB-2的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，BMAL1蛋白的表達(dá)在NPC中被明顯抑制[CK(2.24±0.22)，NPC(0.63±0.11)，P<0.01]，而CerbB-2蛋白的表達(dá)則被明顯上調(diào)[CK(0.89±0.13)，NPC(2.65±0.25)，P<0.01，圖3]。BMAL1和CerbB-2蛋白與基因表達(dá)趨勢(shì)相同，提示BMAL1和CerbB-2可能參與鼻咽癌細(xì)胞的增殖調(diào)控作用。

圖3 BMAL1和CerbB-2蛋白在鼻咽癌CEN1細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 p50和p65基因在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)與CK組相比，NPC組中p50和p65基因表達(dá)水平分別上調(diào)了66.90%和77.68%(P<0.01，圖4)。提示NPC激活了NF-κB信號(hào)通路，使其產(chǎn)生一系列相關(guān)的反應(yīng)。

2.5 p50和p65蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)本研究檢驗(yàn)了p50和p65蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與CK組比較，NPC組中p50和p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯上調(diào)(圖5，P<0.01)。提示NF-κB信號(hào)通路參與鼻咽癌細(xì)胞的調(diào)控作用。

3 討 論

NPC是中國(guó)華南地區(qū)以及東南亞常見(jiàn)的頭頸癌[8-9]。隨著放化療的初步治療，早期NPC的5年總生存期(overall survival, OS)大于90%[10]。然而，復(fù)發(fā)性或原發(fā)性轉(zhuǎn)移性NPC仍然是腫瘤學(xué)研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。盡管聯(lián)合放療/化療對(duì)Ⅰ期和Ⅱ期NPC有療效并能提高患者的生存率，但不幸的是，大多數(shù)NPC是由于非特異性表現(xiàn)癥狀(宮頸節(jié)育、頭痛、鼻腔和聽(tīng)覺(jué)功能障礙)而被診斷為晚期，特別是治療后癥狀的發(fā)作以及對(duì)鼻咽的徹底檢查具有更大的難度[11-12]。因此，需要開(kāi)發(fā)更精確的分子診斷和NPC的靶向治療技術(shù)。為此，本研究探討了NPC中可能的調(diào)控信號(hào)通路和基因表達(dá)情況，以期為其機(jī)制研究提供一定的理論支持。

人體在維持體內(nèi)平衡和適應(yīng)外部環(huán)境的過(guò)程中存在明顯的晝夜節(jié)律變化[13]。晝夜節(jié)律紊亂可能會(huì)增加心血管疾病、免疫性疾病和癌癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[14]。晝夜節(jié)律蛋白BMAL1、CLOCK、PER1和PER2等的正反饋回路調(diào)節(jié)人體的各種生理過(guò)程，包括血壓、激素分泌、睡眠和免疫活動(dòng)[15]。研究表明，可能存在一個(gè)整合的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律變化，包括一般行為、激素合成、體溫和新陳代謝[16-17]。本研究結(jié)果顯示，BMAL1基因在NPC中被明顯下調(diào)，而CerbB-2基因的表達(dá)則明顯上調(diào)，說(shuō)明BMAL1和CerbB-2可能參與鼻咽癌細(xì)胞的增殖調(diào)控作用。

圖4 p50和p65基因在鼻咽癌CEN1細(xì)胞中的表達(dá)

圖5 p50和p65蛋白在鼻咽癌CEN1細(xì)胞中的表達(dá)

BMAL1可通過(guò)炎癥通路NF-κB調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并建立生物鐘與炎癥反應(yīng)之間的聯(lián)系。為了探究NPC的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了細(xì)胞核B因子(NF-κB)的成員p65和p50基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，p50和p65基因在NPC細(xì)胞中均表現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，這說(shuō)明NPC激活了NF-κB信號(hào)通路，使其產(chǎn)生一系列相關(guān)的反應(yīng)。靜息時(shí)IκBα和p65/p50形成復(fù)合物，其在細(xì)胞質(zhì)中無(wú)活性，當(dāng)細(xì)胞被細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，IκBα同時(shí)被磷酸化和降解，并從p65和p50解離，使NF-κB(即p65和p50)暴露于核定位位點(diǎn)。游離的p65和p50迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并與特定序列結(jié)合，調(diào)節(jié)與免疫和炎癥相關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、自身免疫和炎癥[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1可以募集CBP，促進(jìn)p65的乙酰化水平，進(jìn)一步激活p65的表達(dá)并促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路。與這些已報(bào)道的研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果也表明，NPC中p50和p65基因以及蛋白質(zhì)的表達(dá)均明顯上調(diào)，這說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路被這一過(guò)程激活而起到調(diào)節(jié)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，CLOCK-BMAL1復(fù)合物控制RHOA-ROCK-CFL途徑組分的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]。細(xì)胞核中過(guò)多時(shí)鐘基因表達(dá)可能激活NF-κB的表達(dá)[20]，導(dǎo)致過(guò)量的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，而B(niǎo)MAL1下調(diào)可以抑制這種激活反應(yīng)。本研究中，BMAL1在NPC患者中明顯下調(diào)，而p50和p65基因以及蛋白質(zhì)的表達(dá)均明顯上調(diào)，證明BMAL1對(duì)NF-κB信號(hào)通路具有負(fù)調(diào)控作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。LOU等[21]的研究表明，BMAL1可能作為轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄輔因子起作用，或與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被激活時(shí)，p65和p50形成二聚體以結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)靶基因的調(diào)節(jié)[22]。以往的研究證明，BMAL1可以通過(guò)募集CBP乙?；蚇F-κB活化來(lái)增強(qiáng)p65[23]。此外，本研究表明，因BMAL1下調(diào)而提高NF-κB靶基因(p50、p65)的表達(dá)，這可能是由于CBP的積累促進(jìn)了p65的乙酰化，BMAL1募集到NF-kB-p65。因此，本研究揭示了BMAL1和CerbB-2通過(guò)炎癥通路NF-κB調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為鼻咽癌的治療和預(yù)防提供了進(jìn)一步的理論支持。