瑪依努·玉蘇甫，衣巴地古麗·庫(kù)吐魯克，哈尼克孜·阿不都艾尼

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 新疆 烏魯木齊 830000)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT) 是一種常見(jiàn)的自身器官特異性免疫疾病，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，與遺傳、性激素水平、年齡和免疫因素等存在重要聯(lián)系，且存在多因素協(xié)同作用，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。近年來(lái)，研究顯示，機(jī)體自由基誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷與AIT發(fā)病存在密切聯(lián)系，并證實(shí)抗氧化劑如硒和維生素E可改善AIT的高易感小鼠的甲狀腺炎性反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞亞群水平[2]。有研究報(bào)道，強(qiáng)效抗氧化劑α-硫辛酸治療AIT可降低甲狀腺相關(guān)炎性反應(yīng)因子水平[3]。p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)通路通過(guò)激活其下游核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(nuclear transcription factor Kappa B，NF-κB)通路可誘導(dǎo)多種炎性反應(yīng)因子的過(guò)度表達(dá)，并激活機(jī)體炎性反應(yīng)。已有研究證實(shí)，AIT患者存在TNF-α等炎性反應(yīng)因子高表達(dá)，與NF-κB通路間存在正反饋環(huán)的相互調(diào)控關(guān)系，會(huì)加劇炎性反應(yīng)反應(yīng)[4]。本研究以P38MAPK/NF-κB通路來(lái)研究AIT發(fā)病機(jī)制，分析α-硫辛酸對(duì)AIT小鼠的炎性反應(yīng)及淋巴細(xì)胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： SPF級(jí)4周齡NOD.H-2h4雌性小鼠，80只，體質(zhì)量18～22 g，動(dòng)物來(lái)源為廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2017D01C106)。

1.1.2 試劑及試劑盒： α-硫辛酸(Sigma-Aldrich公司)；兔抗p38MAPK、兔抗NF-κB和抗β-actin抗體(Arigo 公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及處理：將80只NOD.H-2h4雌鼠隨機(jī)分為對(duì)照組給予無(wú)菌蒸餾水、AIT組給予50 mg/L碘化鈉無(wú)菌蒸餾水、低劑量以及高劑量α-硫辛酸干預(yù)組分別每天靜脈注射0.1和0.4 g/L α-硫辛酸，每組20只。干預(yù)8周。

1.2.2 HE染色檢測(cè)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)： 取各組動(dòng)物甲狀腺組織采取HE染色法觀察，比較各組NOD.H-2h4雌鼠第8周時(shí)的甲狀腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生率以及浸潤(rùn)程度。根據(jù)各組動(dòng)物甲狀腺組織切片HE染色的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)面積大小，將浸潤(rùn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]分為0～4+共5個(gè)等級(jí)：0表示正常；1+表示1%～10%；2+表示10%～30%；3+表示30%～50%；4+表示超過(guò)50%。

1.2.3 小鼠甲狀腺炎性反應(yīng)程度評(píng)分： 當(dāng)小鼠甲狀腺腺體中炎細(xì)胞與腺面積比值超過(guò)2%，表示小鼠發(fā)生甲狀腺炎。每只小鼠分別取3塊不連續(xù)的甲狀腺組織切片后測(cè)定，并取測(cè)定平均值作為評(píng)分值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟Th17、Treg、CD4+及CD8+等T細(xì)胞水平： 比較各組小鼠脾組織中Tregs、Th17細(xì)胞比例：取各組動(dòng)物脾臟，勻漿后，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞; 將其加入培養(yǎng)板中進(jìn)行孵育，4 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟組織中Th17、Treg等輔助性T細(xì)胞數(shù)量比例以及CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比以及CD4+/CD8+等。

1.2.5 Western blot檢測(cè)各組小鼠p38MAPK、NF-κB蛋白水平： 剪取各組小鼠甲狀腺組織并經(jīng)超聲裂解，以99∶1比例加入裂解緩沖液，當(dāng)組織進(jìn)行充分勻漿后將其靜置一段時(shí)間，12 000 r/min離心20 min，取上清，用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。用10% SDS-PAGE對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液將樣品于室溫下封閉1 h，按1 000倍稀釋，將膜轉(zhuǎn)入封閉液稀釋的一抗：兔抗p38MAPK、兔抗NF-κB、兔抗β-actin抗體，4 ℃過(guò)夜，然后加相應(yīng)的二抗，按1 000倍稀釋，過(guò)夜后使用PBS沖洗洗液洗滌，電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)并進(jìn)行印跡成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組甲狀腺組織學(xué)變化

干預(yù)8周后，AIT組小鼠甲狀腺炎性反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)85%，AIT+低/高劑量α-硫辛酸組小鼠甲狀腺炎發(fā)生率顯著低于AIT組(P<0.001)。干預(yù)8周后，AIT+低/高劑量α-硫辛酸兩組小鼠甲狀腺炎性反應(yīng)程度評(píng)分相比AIT組均明顯下降(P<0.05)(圖1)。

2.2 各組Th17、Treg、CD4+及CD8+T細(xì)胞水平比較

與對(duì)照組相比，AIT組小鼠脾組織Th17細(xì)胞比例顯著升高，而Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)。AIT+低/高劑量α-硫辛酸組小鼠Th17細(xì)胞比例相比AIT組顯著降低(P<0.05)，Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+細(xì)胞比例相比AIT組顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 各組p38MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)水平的比較

AIT組甲狀腺組織p38MAPK和NF-κB的p38MAPK和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，AIT+低/高劑量α-硫辛酸兩組以上指標(biāo)表達(dá)水平較AIT組和對(duì)照組均降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with AIT group圖1 各組甲狀腺炎發(fā)生率與炎性反應(yīng)評(píng)分比較Fig 1 Comparison of the incidence and inflammation scores of thyroiditis in each n=20)

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with AIT group圖2 各組Th17、Treg以及CD4+，CD8+T細(xì)胞水平比較Fig 2 Comparison of Th17, Treg and CD4+, CD8+ T cell levels in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with AIT group圖3 Western blot檢測(cè)各組p38MAPK和NF-κB蛋白水平Fig 3 Western blot detection of p38MAPK and NF-κB protein levels in each n=20)

3 討論

AIT作為一種自身免疫性疾病，自身免疫因素與該疾病的發(fā)生和發(fā)展存在緊密聯(lián)系。T淋巴細(xì)胞作為機(jī)體質(zhì)量要的免疫細(xì)胞，一般分為CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群，維持兩個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群正常水平[5]。NF-κB作為p38MAPK的下游信號(hào)因子，經(jīng)磷酸化活化的p38MAPK可誘導(dǎo)NF-κB活化至關(guān)重要[6]。以往研究證實(shí)Th17、Treg作為自身免疫病的重要炎性介質(zhì)，機(jī)體內(nèi)IL-17、IL-12以及TNF-α等炎性反應(yīng)因子水平的升高可以激活NF-κB信號(hào)通路，被活化后的NF-κB通路可以促使T細(xì)胞發(fā)生分化，進(jìn)一步對(duì)炎性因子產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)，從而放大炎性信號(hào)并介導(dǎo)免疫應(yīng)答的發(fā)生[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑在一定程度上可減輕AIT小鼠炎性反應(yīng)水平[8]。近年研究證實(shí)，α-硫辛酸對(duì)自身免疫性炎性反應(yīng)疾病具有保護(hù)功能，可通過(guò)調(diào)節(jié)甚至抑制NF-κB信號(hào)通路的活化狀態(tài)以減輕機(jī)體的炎性反應(yīng)[9]。本文研究結(jié)果顯示，低/高劑量α-硫辛酸干預(yù)小鼠后的甲狀腺炎發(fā)生率及甲狀腺炎的炎性反應(yīng)程度評(píng)分顯著降低，而Th17細(xì)胞比例顯著升高， Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+細(xì)胞比例顯著降低。AIT+低/高劑量α-硫辛酸組小鼠Th17細(xì)胞比例相比AIT組顯著降低，Treg、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+細(xì)胞比例相比AIT組顯著升高。以上結(jié)果提示，α-硫辛酸可有效降低AIT小鼠CD4+等免疫細(xì)胞水平，從而緩解甲狀腺炎性反應(yīng)程度，但高低劑量的α-硫辛酸之間無(wú)顯著性差異，可能與樣本量較小有關(guān)，α-硫辛酸的作用劑量需要深入研究以進(jìn)一步明確。α-硫辛酸處理AIT小鼠后的血清中Th17、Th1和Treg類細(xì)胞因子(IL-10)達(dá)水平均發(fā)生明顯改善[10]，與本文研究結(jié)果相一致，說(shuō)明α-硫辛酸可能是通過(guò)影響Th1、Th17、Th22以及Treg等免疫細(xì)胞水平，改善AIT小鼠的病情。另外，本文研究結(jié)果顯示，低/高劑量α-硫辛酸干預(yù)小鼠的p38MAPK、NF-κB的蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯較低，這說(shuō)明α-硫辛酸可以抑制p38MAPK蛋白表達(dá)水平[11]。

綜上所述，α-硫辛酸可以通過(guò)調(diào)控p38MAPK/NF-κB通路，降低自身免疫性甲狀腺小炎性反應(yīng)因子表達(dá)，改善淋巴細(xì)胞亞群的比例，從而抑制炎性反應(yīng)反應(yīng)和改善AIT癥狀。