王晶波，劉婷婷，任 碩，楊 倬，秦 文，王麗媛，卓 勤，宮照龍，沈 葹

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，國(guó)家衛(wèi)生健康委微量元素營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

牛肝菌（Boletus spp.）是一種食藥兼用的大型真菌，其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和鐵、鋅、鈣等礦物質(zhì)元素[1-2]，以及多糖、多酚、萜類等具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力等作用的功效成分[3-6]，在人體保健和疾病治療方面有巨大的發(fā)展?jié)摿7]。全世界已知牛肝菌屬菌類已有1 024種，我國(guó)已知可食用的就有199種[8]。其分布廣泛，云南是我國(guó)牛肝菌種類最豐富的地區(qū)之一[9-10]，云南產(chǎn)牛肝菌占我國(guó)牛肝菌出口量的70%[11]。

目前對(duì)牛肝菌的相關(guān)研究多為種類的鑒別和保存方法，營(yíng)養(yǎng)成分、功效成分的相關(guān)研究多集中在新鮮牛肝菌的研究。牛肝菌種類繁多，生活中人們常食用的種類卻為少數(shù)，多以菌類的顏色區(qū)分，包括白、黃、黑、紅等。除旺季外，農(nóng)民保存牛肝菌多采用烘干或曬干技術(shù)，該技術(shù)會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)成分和結(jié)構(gòu)的變化，為充分利用干品的營(yíng)養(yǎng)成分，有必要對(duì)常見(jiàn)牛肝菌的干貨商品進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析。

挑選云南當(dāng)年產(chǎn)的、生活中最常見(jiàn)的5種野生牛肝菌干品進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析，包括蛋白質(zhì)和氨基酸組成、礦物質(zhì)元素、多糖和多酚的含量，以及多酚的DPPH·清除能力和ABTS·清除能力。綜合評(píng)價(jià)了5種牛肝菌的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，補(bǔ)充《中國(guó)食物成分表》牛肝菌干品的數(shù)據(jù)空白，為提升牛肝菌的功效價(jià)值與市場(chǎng)開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

野生牛肝菌干品樣品，市售。5種牛肝菌名稱和產(chǎn)地分別為白牛肝菌（Boletus albus，楚雄）、紅牛肝菌（Boletus rubeus，普洱）、黃牛肝菌（Boletus auripes，大姚）、黑牛肝菌（Boletus nigricans，師宗）、美味牛肝菌（Boletus edulis，普洱），設(shè)為樣品1號(hào)～5號(hào)。將樣品粉碎，過(guò)120目篩后置陰涼干燥處備用。

混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（2.5 μmoL·mL-1），Wako公司；單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鉀（1 000 μg·mL-1）、鈣（100 μg·mL-1）、鈉（100 μg·mL-1）、鎂（1 000 μg·mL-1）、鐵（100 μg·mL-1）、錳（100 μg·mL-1）、銅（100 μg·mL-1）、鋅（100 μg·mL-1）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（89.9%），中國(guó)食品藥品檢定院；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（95%）、左旋抗壞血酸（SLBL9227V），F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑、碳酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS） Sigma Aldrich公司；過(guò)硫酸鉀，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無(wú)水乙醇、硫酸、濃鹽酸、苯酚，北京化工廠，為分析純。

L-8900型氨基酸分析儀和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)U-3900，日本日立公司；Neixon350D型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)PerkinElmer公司；Mars6-Express型高壓微波消解儀，美國(guó)CEM公司；Spectra-Max i3x酶標(biāo)儀，美國(guó)molecular devices公司；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（功率600 W，頻率40 000 Hz），昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 牛肝菌氨基酸含量測(cè)定及氨基酸評(píng)分

稱取牛肝菌樣品約0.15 g于水解管中，用含0.05%巰基乙酸的鹽酸溶液水解提取22 h，冷卻后將水解液轉(zhuǎn)移并定容至50 mL。吸取過(guò)濾后水解液1 mL于50℃水浴中濃縮至固體，用2.0 mL的0.02 mol·L-1稀鹽酸復(fù)溶，過(guò)濾后測(cè)定。所有樣品進(jìn)行2次平行測(cè)定，結(jié)果以均值表示。氨基酸色譜條件參照參考文獻(xiàn)[12]，并做適當(dāng)處理；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[13]。

氨基酸評(píng)分（AAS）[14]：將樣品中必需氨基酸含量與世界衛(wèi)生組織（WHO） 的參考蛋白質(zhì)中必需氨基酸進(jìn)行比較，比值最低者為限制氨基酸。限制氨基酸的比值乘以100，即為該樣品的氨基酸評(píng)分（AAS），并與香菇、茶樹菇和雞菌等食用菌（干）的相應(yīng)AAS進(jìn)行比較。

1.3 牛肝菌礦物質(zhì)元素含量測(cè)定

礦物質(zhì)元素含量測(cè)定采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法[15]，稱取0.3 g樣品與硝酸6 mL～8 mL混合于消解罐中冷消化，過(guò)夜。消解完成后自然冷卻至室溫，在電熱板加熱至120℃～160℃，開蓋趕酸至剩余溶液1 mL左右，冷卻后用去離子水轉(zhuǎn)移并定容至25 mL，搖勻，供上機(jī)備用，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。儀器采用最佳技術(shù)參數(shù)與設(shè)定值，其中等離子體RF功率：1 500 W；冷卻氣氬氣流速：15 L·min-1；霧化器氬氣流速：1 L·min-1；輔助氣體流速：1.2 L·min-1；采樣深度：6.4 mm；進(jìn)樣穩(wěn)定時(shí)間：15 s；泵速：30 r·min-1；重復(fù)次數(shù)：3 次。

1.4 牛肝菌多糖提取及含量測(cè)定

采用超聲波提取法最佳工藝[16]提取5種牛肝菌多糖。每種樣品稱取1 g粉末，按照料液比1∶30加入蒸餾水，超聲溫度50℃、超聲25 min后4 500 r·min-1離心吸取上清液，加入無(wú)水乙醇至終濃度70%沉淀多糖，4℃過(guò)夜，4 500 r·min-1離心棄上清，無(wú)菌蒸餾水定容至25 mL，即為牛肝菌多糖提取液，于4℃保存?zhèn)溆谩２捎帽椒?硫酸分光光度測(cè)定法，測(cè)定牛肝菌多糖含量。

1.5 牛肝菌多酚提取及多酚含量測(cè)定

采用超聲波提取法最佳工藝[4]提取5種牛肝菌多酚。每種樣品稱取1 g粉末，按照料液比1∶44，加入85%的乙醇溶液，超聲38 min后4 500 r·min-1離心15 min，吸取上清液并用85%乙醇溶液定容至50 mL，即為牛肝菌多酚提取液，于-20℃保存?zhèn)溆?。采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定多酚含量，在96孔板上分別加入 30 μL的多酚提取液樣品、150 μL Folin-Ciocalteu試劑（0.2 mol·L-1）和120 μL碳酸鈉溶液（75 g·L-1），室溫暗處反應(yīng)2 h后，在酶標(biāo)儀于760 nm下測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸（8.75 μg·mL-1、17.5 μg·mL-1、35 μg·mL-1、70 μg·mL-1、140 μg·mL-1、280 μg·mL-1）為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取多酚含量以每克食用菌中沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)。

1.6 牛肝菌多酚DPPH·清除能力檢測(cè)

取15 μL多酚提取液于96孔板中，每孔加入225 μL DPPH（0.02 mg·mL-1），室溫避光反應(yīng)15 min，于517 nm測(cè)吸光度值，以乙醇代替樣品溶液做空白對(duì)照，采用抗壞血酸 （5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mgL-1）做為陽(yáng)性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抗壞血酸當(dāng)量AEAC（antioxidant equivalent ascorbic acid content，AEAC） 計(jì)算多酚含量，同時(shí)計(jì)算1 g食用菌提取的多酚對(duì)DPPH·清除率（E1，%），計(jì)算公式為：

式中：OD1為空白吸光度；OD2為樣品吸光度。

1.7 牛肝菌多酚ABTS·清除能力檢測(cè)

分別配制ABTS溶液（7.4 mmol·L-1）和過(guò)硫酸鉀溶液（2.6 mmol·L-1），將二者等體積混合，暗處、室溫靜置16 h后，用PBS（pH 7.4） 稀釋合適比例（約10倍左右），調(diào)制成734 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.700±0.010，即為ABTS·工作液。取50 μL多酚提取液于96孔板中，每孔加入200 μL ABTS·自由基工作液，室溫避光反應(yīng)6 min，于734 nm測(cè)吸光度值，以乙醇代替樣品溶液做空白對(duì)照，采用抗壞血酸 （5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1）做為陽(yáng)性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抗壞血酸當(dāng)量計(jì)算多酚含量，同時(shí)計(jì)算1 g食用菌提取的多酚對(duì)ABTS·清除率（E2，%），計(jì)算公式為：

式中：OD3為空白吸光度；OD4為樣品吸光度。

2 結(jié)果

2.1 牛肝菌氨基酸測(cè)定結(jié)果

5種牛肝菌樣品氨基酸測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品中蛋白質(zhì)和氨基酸含量分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of protein and amino acid content in samples

由表1可知，5種牛肝菌氨基酸總量平均為16.62 g·100-1g-1，必需氨基酸平均為 7.904 g·100-1g-1，占氨基酸總量的47.400%，其中谷氨酸含量最高，達(dá)到2.679 g·100-1g-1，天冬氨酸、纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸含量也較高。美味牛肝菌氨基酸含量最高（25.910 g·100-1g-1），是黑牛肝菌氨基酸含量（12.120 g·100-1g-1）的2倍。

根據(jù)必需氨基酸與參考蛋白質(zhì)中必需氨基酸的比值，確定異亮氨酸為限制氨基酸，計(jì)算出牛肝菌的AAS，見(jiàn)表2。

表2 牛肝菌的氨基酸評(píng)分Tab.2 Amino acid score of Boletus spp.

由表2可知，樣品中必需氨基酸總量達(dá)到377.98 mg·g-1，高于 WHO蛋白標(biāo)準(zhǔn)模式（315.00 mg·g-）1，即為優(yōu)質(zhì)蛋白。牛肝菌的AAS平均為81.3。與其他食用菌的氨基酸含量比較結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，美味牛肝菌的必需氨基酸含量為12.580 g·100-1g-1，高于茶樹菇和雞菌等食用菌的相應(yīng)氨基酸含量。

2.2 牛肝菌礦物質(zhì)元素含量測(cè)定

表3 牛肝菌、美味牛肝菌與其他食用菌比較Tab.3 Comparison among Boletus spp.,Boletus edulis and other edible fungi

采用檢測(cè)靈敏度高、強(qiáng)勢(shì)的抗干擾能力和快速分析結(jié)果的ICP-MS法分析5種牛肝菌的礦物質(zhì)元素，包括鈉、鎂、鉀、鈣、鐵、鋅、錳、銅8種元素，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5種牛肝菌礦物質(zhì)元素含量Tab.4 Mineral elements of five varieties of Boletus spp.

由表4可知，每100克牛肝菌樣品中，鋅元素平均含量最高（55.580 0 mg）；鉀、鐵、鈉、鎂、鈣、錳和銅的含量分別為50.000 0 mg、17.300 0 mg、8.220 0 mg、4.840 0 mg、1.400 0 mg、0.974 0 mg和0.099 8 mg，其中鋅和鐵含量明顯高于香菇、茶樹菇，表明牛肝菌為富鋅的健康食材，其中黃牛肝菌的鋅含量（88.6 mg·100-1g-1）最高，白牛肝菌次之，黑牛肝菌鋅含量最低，5種牛肝菌的礦物質(zhì)元素含量存在差異。

2.3 牛肝菌多糖和多酚的含量測(cè)定

采用超聲波法提取5種牛肝菌的多糖和多酚，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，5種牛肝菌之間多糖提取率差異大，從高到低依次是黃牛肝菌、美味牛肝菌、白牛肝菌、紅牛肝菌和黑牛肝菌；黃牛肝菌的多糖提取率最高為57.30 mg·g-1，是黑牛肝菌提取率（最低，12.16 mg·g-1）的4.71倍，近似第二位美味牛肝菌的2倍。而牛肝菌多酚提取率差異不大，從高到低依次是美味牛肝菌、白牛肝菌、黃牛肝菌、紅牛肝菌和黑牛肝菌；美味牛肝菌和白牛肝菌多酚提取率接近，分別為9.45 mg·g-1和9.39 mg·g-1。另外，5種牛肝菌都具有DPPH·清除能力和ABTS·清除能力，其中美味牛肝菌的ABTS·清除能力最強(qiáng)，抗壞血酸當(dāng)量達(dá)到9.58 mg AEAC·g-1，清除率為41.22%，美味牛肝菌的DPPH·清除能力略次于白牛肝菌，其抗壞血酸當(dāng)量達(dá)到6.51 mg AEAC·g-1，清除率為19.45%。5種牛肝菌中，黑牛肝菌的多糖提取率、多酚提取率和多酚抗氧化能力最差。

表5 5種牛肝菌多糖、多酚提取率和多酚抗氧化能力檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Results of the extraction rates of polysaccharides,polyphenol and polyphenol antioxidant capacity of five varieties of Boletus spp.

多酚提取率與其抗氧化能力相關(guān)性分析見(jiàn)表6。

表6 多酚提取率和抗氧化功能的相關(guān)性分析Tab.6 Correlation analysis of polyphenol extraction rate and antioxidant capacity

由表6可知，多酚提取率與多酚的抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是0.813 2～1.000 0。

3 結(jié)論

綜上所述，5種牛肝菌在氨基酸含量、礦物質(zhì)元素、多糖和多酚等方面均有差異，各有所長(zhǎng)。牛肝菌富含谷氨酸、天冬氨酸等呈味氨基酸，這也是牛肝菌味道鮮美的原因，其中美味牛肝菌的氨基酸最豐富，明顯高于其他4種牛肝菌。黃牛肝菌的微量元素鋅含量最高，白牛肝菌次之。黃牛肝菌的多糖提取率最高，美味牛肝菌和白牛肝菌次之。美味牛肝菌和白牛肝菌的多酚提取率和抗氧化能力接近，均高于其他3種牛肝菌。5種牛肝菌中黑牛肝菌的氨基酸含量、鋅含量、多糖和多酚提取率都是最低的，但是黑牛肝菌的鉀含量最高。

針對(duì)云南5種常見(jiàn)野生牛肝菌干貨進(jìn)行基本營(yíng)養(yǎng)成分分析，為牛肝菌作為食品加工原料時(shí)選擇適宜品種提供參考，同時(shí)牛肝菌的抗氧化能力也為營(yíng)養(yǎng)性、功能性菌類食品的研發(fā)提供了較大的發(fā)展空間。另外，需要進(jìn)一步完善對(duì)牛肝菌其他營(yíng)養(yǎng)成分的研究，系統(tǒng)全面地評(píng)價(jià)牛肝菌的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為合理開發(fā)牛肝菌市場(chǎng)價(jià)值提供理論依據(jù)。