龍航宇，呂夢娜，郭宸旭，尹樂子，林瑞慶

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東 廣州 510642；2. 廣東科貿(mào)職業(yè)學院，廣東 廣州 510430 ； 3. 廣州鐵路職業(yè)技術(shù)學院，廣東 廣州 510430)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種機會性致病的革蘭陽性人獸共患病病原菌，它在自然界中的分布范圍很廣，根據(jù)細菌所產(chǎn)生的4種毒素(α，β，ε和ι)可分為A、B、C、D和E五個型，引起雞壞死性腸炎(Necrotic enteritis，NE)主要為A型，近年的研究表明，該病也跟NetB毒素有關(guān)[1]。目前家禽NE的預防和治療仍以抗生素為主，但自歐盟等陸續(xù)立法在飼料中禁用抗生素添加劑以來，間接促進壞死性腸炎流行，雞壞死性腸炎的重要性逐漸提高[2-3]。對于NE病原學及防控相關(guān)研究需要有可靠且可重復的動物模型，本試驗以國內(nèi)分離的堆型、巨型、柔嫩和毒害4種艾美耳球蟲分別與產(chǎn)氣莢膜梭菌廣東株共同感染嶺南黃雞，對雞只存活率、體重增長、料肉比、病變計分等數(shù)據(jù)進行比較分析，增進了解產(chǎn)氣莢膜梭菌與球蟲在腸炎發(fā)病上的協(xié)同關(guān)系，為建立可靠的產(chǎn)氣莢膜梭菌與艾美耳球蟲國內(nèi)分離株共感染模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株及卵囊 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌廣東分離株Cp2-4，為本實驗室分離、鑒定和保存。柔嫩、毒害、巨型、堆型艾美耳球蟲強毒株由本實驗室保存。

1.1.2 試驗動物 1日齡嶺南黃雞苗，購自廣東省農(nóng)科院畜牧研究所，無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)至14日齡備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 處理及分組 試驗一：將60只14日齡供試雞隨機分成6組(A1～A6)，每組10只，感染情況如下:A1組：不感染；A2組：1×109CFU產(chǎn)氣莢膜梭菌/只；A3組：10 000個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；A4組：每1×109CFU產(chǎn)氣莢膜梭菌/只和10 000個 毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；A5組：30 000個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；A6組：1× 109CFU產(chǎn)氣莢膜梭菌/只和30 000個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊/只。

試驗二：將60只14日齡供試雞隨機分成6組(B1～B6)，每組10只，感染情況如下：B1組：不感染；B2組：1×109CFU產(chǎn)氣莢膜梭菌/只；B3組：20 000個 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；B4組：每1×109CFU產(chǎn)氣莢膜梭菌/只和20 000個柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；B5組：30 000個堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；B6組：1×109CFU產(chǎn)氣莢膜梭菌/只和30 000個堆型美耳球蟲孢子化卵囊/只。

在17日齡時將飼料(含23%的蛋白質(zhì))替換成35%高蛋白飼料；18日齡時稱量所有組體重及飼料重，并按表1和表2分組感染1×109CFU/只的產(chǎn)氣莢膜梭菌Cp2-4。在20日齡時稱量體重及料重，每組剖殺5只雞，進行病變計分。

1.2.2 測定指標

存活率=(試驗結(jié)束時存活雞只數(shù)/試驗組雞只總數(shù))×100%

平均增重=(最后存活的雞只總重/存活的雞只數(shù))-(試驗開始雞只總重/開始時雞只數(shù))

相對增重率=感染組的平均增重/不感染對照組的平均增重×100%

料肉比=消耗飼料總量(kg)/增重總量(kg)

小腸中段病變計分：0分，無肉眼可見變化；1分， 腸壁變薄或者小腸易碎；2分，局灶性壞死或潰瘍；3分，大塊壞死斑。

1.2.3 統(tǒng)計與分析 用GraphPad Prism 5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析對兩組數(shù)據(jù)間進行差異分析，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 存活率 試驗一中單獨感染產(chǎn)氣莢膜梭菌組(A2)死亡1只雞，存活率為90%，其他各組存活率均為100%；試驗二中堆型+產(chǎn)氣莢膜梭菌組(B6)死亡1只雞，存活率為90%，其他各組存活率均為100%。試驗雞死亡發(fā)生在產(chǎn)氣莢膜梭菌人工感染之前，分析為非病原感染死亡，各組存活率無明顯差異。

2.2 相對增重率 感染產(chǎn)氣莢膜梭菌前，各組相對增重差異不明顯，感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后，如表1所示，與陰性組(A1)相比，單獨感染產(chǎn)氣莢膜梭菌(A2)體重有下降，而毒害/巨型+產(chǎn)氣莢膜梭菌組(A4和A6)體重下降更明顯，共感染致病影響顯著；而表2中顯示，共感染柔嫩艾美耳球蟲與產(chǎn)氣莢膜梭菌(B4)其相對增重下降明顯，而共感染堆型艾美耳球蟲與梭菌(B6)其相對增重下降不明顯。

表1 試驗一相對增重影響比較Table 1 Comparison of relative weight gain of experiment 1

表2 試驗二相對增重比較Table 2 Comparison of relative weight gain of experiment 2

2.3 料肉比 相比對照組，各共感染組致病引起料肉比變化較大。在毒害/巨型+產(chǎn)氣莢膜梭菌試驗中，單獨感染梭菌組在感染梭菌后料肉比升高，毒害組、毒害+梭菌組及巨型+梭菌組料肉比由于試驗雞臨床癥狀較為嚴重，體重增長為負值，致料肉比也是負值；柔嫩/堆型+產(chǎn)氣莢膜梭菌試驗中，各感染組的料肉比都有升高，柔嫩組和柔嫩+梭菌組料肉比升高明顯。見表3。

表3 料肉比比較Table 3 Comparison analysis of feed meat ratio

2.4 病變計分 如圖1A所示，毒害+梭菌組與毒害組之間差異極顯著(P<0.001)，巨型+梭菌組與巨型組之間差異極顯著(P<0.001)；圖1B中柔嫩組與柔嫩+梭菌組以及堆型組與堆型+梭菌組之間差異不顯著。

圖1 腸道病變計分比較分析Fig. 1 Comparison analysis of gut lesion scoringA：毒害或巨型艾美耳球蟲與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染病變計分； B：柔嫩或堆型艾美耳球蟲與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染病變計分A:Gut lesion scoring of coinfections with E. necatrix(N) or E. maxima(M) and C.perfringens(Cp)； B:Gut lesion scoring of coinfections with E. tenella(T) or E. acervuline(A) and C.perfringens (Cp)**：P<0.01

3 討論

由于耐藥性問題以及飼料中抗生素的限制使用，雞壞死性腸炎發(fā)病率持續(xù)上升，尤其在養(yǎng)殖密度大和養(yǎng)殖條件差的環(huán)境下，發(fā)病越發(fā)嚴重，雞大量死亡及其生產(chǎn)性能下降，帶來巨大經(jīng)濟損失。建立產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)病模型，有利于尋找預防和治療該病的新方法。人工發(fā)病動物模型中，引起壞死性腸炎，需適當?shù)靥砑虞o助其發(fā)病的條件[4]。球蟲的感染導致腸內(nèi)環(huán)境的改變被認為是觸發(fā)壞死性腸炎發(fā)生的一個主要因素；飼料的改變，尤其高蛋白飼料也是一個常見的誘發(fā)因素[5-6]。本次試驗使用4種雞艾美耳球蟲，配合飼料的改變，與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染試驗雞，模擬壞死性腸炎發(fā)病，以探究其對生產(chǎn)性能的影響。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌有一定的毒力，單獨感染能引起雞的相對增重下降，除堆型艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌的共感染組合外，其他3種共感染組均促進壞死性腸炎病變的發(fā)生，相對增重比單獨感染產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著下降。毒害或巨型艾美耳球蟲的共感染致病作用更加明顯，由于體重下降多導致增重量為負值，病變計分與單獨感染產(chǎn)氣莢膜梭菌組相比差異顯著。綜合相對增重、料肉比及病變計分等指標，在飼料轉(zhuǎn)為高蛋白情況下，毒害艾美耳球蟲/巨型艾美耳球蟲+產(chǎn)氣莢膜梭菌均能有效地引發(fā)試驗雞壞死性腸炎，對生產(chǎn)性能影響較嚴重。

NE動物模型是研究和防控該病的有利工具，但就目前國外已進行的一些研究，因為影響因素眾多，很難判定哪種動物模型更理想，本試驗參考國外的一些研究資料，對國內(nèi)不同種球蟲分離株及產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株共感染引致的試驗性NE進行比較分析，驗證其對試驗雞生產(chǎn)性能的影響，為進一步建立穩(wěn)定的共感染NE動物模型提供科學依據(jù)，有助于研究NE的發(fā)病機理、病原與宿主的相互作用以及疾病預防和控制措施。