孫 赫，張桉潮，郭 越，黃 晨，張亞超，李 航，張 益，關松磊，張林波

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118 ； 2.遼源市經(jīng)濟技術合作局投資促進中心 , 吉林 遼源 136200；3.遼源市婦嬰醫(yī)院，吉林 遼源 136200)

多黏菌素是一種聚陽離子抗菌肽，被廣泛用于治療革蘭陰性菌引起的全身感染，但是由于多黏菌素具有神經(jīng)毒性和腎毒性等缺陷，從20世紀80年代開始，已經(jīng)逐漸被低毒性的新型抗生素取代，只在畜牧養(yǎng)殖中用于預防和治療畜禽胃腸道疾病。近年來，隨著多重耐藥革蘭陰性菌的增多，尤其是耐碳青霉烯腸桿菌的出現(xiàn)，使人畜面臨“無藥可用”的威脅。多黏菌素作為抗擊多重耐藥革蘭陰性菌感染的 “最后一道防線”顯得尤為重要[1]。但是2015年，中國科學家首次報道了質(zhì)粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1(Mobile colistin resistance)[2]，隨后全世界40多個國家都出現(xiàn)了有關mcr-1的報道[3]，mcr-1的廣泛傳播使人畜真正陷入了“無藥可用”尷尬境地。目前為止，對于mcr-1陽性病原菌的一些流行病學特征還知之甚少，本文主要從吉林省范圍內(nèi)收集鑒定雞源攜帶mcr-1耐藥基因的大腸桿菌，重點分析mcr-1陽性大腸桿菌的流行特征，為今后深入開展耐黏菌素腸桿菌的耐藥性、致病性等生物學研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 從吉林省14個采集點的規(guī)?；B(yǎng)殖場采集雞源肛門拭子樣本273份，內(nèi)臟樣本124份，水樣67份，土樣54份，空氣樣本12份，通過分離純化得到408株雞源大腸桿菌。標準菌株ATCC25922，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。本文中出現(xiàn)的菌株編號是根據(jù)采集地點自行編號，與菌株類型無關。

1.2 藥物與試劑 多黏菌素B(Polymyxin B)、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、4S Green Plus核酸染料、DL-2 000 DNA Marker，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；LB肉湯、麥康凱瓊脂、MH肉湯(MHB)、MH瓊脂(MHA)，均購自青島海博生物公司；2×TaqMaster Mix，購自寶生物工程(大連)有限公司；Constar 96孔細胞培養(yǎng)板，購自北京思量長遠生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 雞肛拭子的采集：使用無菌的棉拭子采集雞泄殖腔周圍糞便樣本，并低溫保存于含有LB肉湯培養(yǎng)基的15 mL離心管中。內(nèi)臟樣本采集：解剖后收集內(nèi)臟低溫保存于無菌采樣袋中?？諝鈽颖静杉簩⒚芊恹溈祫P瓊脂培養(yǎng)基打開，靜置于室內(nèi)10 min，密封后低溫保存。水樣采集：分別采集養(yǎng)殖場內(nèi)雞飲用水、水箱內(nèi)水、人飲用水各10 mL于15 mL無菌離心管，密封后低溫保存。土壤樣本采集：分別收集養(yǎng)殖場內(nèi)以及周圍10 m、20 m、50 m處土壤，低溫保存。

1.3.2 大腸桿菌的分離鑒定 采集的樣本經(jīng)過不同預處理后劃線于麥康凱培養(yǎng)基，至于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～24 h。用無菌接菌環(huán)挑取磚紅色、圓形凸起的單一菌落在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。對純化菌進行革蘭染色并鏡檢。將挑取可疑菌落37 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h，分別提取基因組DNA和質(zhì)粒DNA待用。使用特異性大腸桿菌16S rDNA鑒定引物[4]進行大腸桿菌鑒定，并利用DNAMAN軟件進行同源性比較。

1.3.3 耐多黏菌素大腸桿菌的篩選鑒定 將篩選出的大腸桿菌利用含有4 μg/mL 多黏菌素的麥康凱培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h。篩選出耐多黏菌素大腸桿菌，使用mcr-1特異性引物進行鑒定[2]。并且按照2017年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法檢測細菌對多黏菌素的最低抑菌濃度(MIC)。以標準菌ATCC25922作為對照，多黏菌素濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL和0.25 μg/mL。每株菌設置3組重復，結果判讀以小孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。

1.3.4 質(zhì)粒類型鑒定 使用 23種質(zhì)粒類型的特異性引物進行鑒定[4-6]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.5 藥物敏感性及耐藥基因檢測 利用紙片擴散法測定mcr-1陽性大腸桿菌對氧氟沙星、阿米卡星、頭孢他啶、亞胺培南、氟苯尼考、氯霉素、慶大霉素、阿莫西林、四環(huán)素、米諾環(huán)素、磷霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟共14種抗生素的敏感性，并以ATCC25922作為質(zhì)控菌。依據(jù)CLSI發(fā)布的《抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準》進行結果判定。采用PCR方法對質(zhì)粒攜帶的多藥耐藥基因進行檢測，具體包括：四環(huán)素類耐藥基因(tetA、tetB、tetM)、磷霉素類耐藥基因(fosA3)、喹諾酮類耐藥基因(oqxA、oqxB、qnrA、qnrB、qepA)、廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaKPC、blaCTX-M-9G)進行檢測。

2 結果

2.1mcr-1陽性大腸桿菌的鑒定 分離得到的406株大腸桿菌中22株mcr-1為陽性，陽性率為5.42%。其中從雞源拭子樣本分離到273株大腸桿菌，mcr-1陽性19株，陽性率6.96%；雞舍內(nèi)空氣樣本12個，陽性3個，陽性率25%；雞舍周圍土壤和水樣本共計121個，均未檢出陽性菌株。22株大腸桿菌對多黏菌素的MIC范圍為1～16 μg/mL，其中16 μg/mL(14/22，63.64%)、8 μg/mL(2/22，9.09%)、4 μg/mL(1/22，4.55%)、2 μg/mL(3/22，13.64%)、1 μg/mL(2/22，9.09%)。見圖1。

圖1 多黏菌素耐藥基因mcr-1電泳鑒定結果Fig.1 Electrophoretic identification of polymyxin resistance gene mcr-1M: BM2 000+ marker; 1: JZ10; 2: LT6; 3: XD1-2; 4: XD1-2; 5: LT5-2; 6: GZ15; 7: H4; 8: H3-2; 9: GZ2;10: GA3-2; 11: GA4; 12: ZLZ; 13: GA3-1; 14: ZL6-2; 15: ZL7; 16: ZL2; 17: XWJ9; 18: BCC1;19: QALAK1-2; 20: QAL1-1; 21: QALBK; 22: FTK

2.2 吉林省mcr-1陽性大腸桿菌的地區(qū)分布情況 在吉林省雞主要養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)選擇了14個采集點，分別位于吉林市龍?zhí)秴^(qū)前阿拉、吉林市永吉縣、榆樹市弓棚鎮(zhèn)、舒蘭市溪河鎮(zhèn)、蛟河市南大屯、長春市農(nóng)安縣、松原市長嶺縣、德惠市布海鎮(zhèn)、德惠市后岫巖窩堡、扶余市新源鎮(zhèn)、扶余市陶賴昭鎮(zhèn)、大安市樂勝鄉(xiāng)，其中8個采集點檢測出mcr-1陽性大腸桿菌，其中長春市永吉縣的陽性率最高。

表1 吉林省mcr-1陽性大腸桿菌的地區(qū)分布情況

2.3 多重耐藥分析

2.3.1 藥物敏感性分析 22株mcr-1陽性大腸桿菌中，氯霉素、阿莫西林、四環(huán)素、頭孢噻肟耐藥率均為100.00%，氧氟沙星耐藥率86.36%，阿米卡星耐藥率40.91%，頭孢他啶耐藥率54.55%，亞胺培南耐藥率18.18%，氟苯尼考耐藥率95.45%，慶大霉素耐藥率96.36%，磷霉素耐藥率40.91%，多西環(huán)素耐藥率90.90%，環(huán)丙沙星耐藥率95.45%。見表2。

表2 22株mcr-1陽性大腸桿菌對 14種抗菌藥物敏感性Table 2 Antibiotic susceptibility of 22 E.coli isolats with mcr-1 to 14 kinds of antibiotics (%)

2.3.2 多藥耐藥基因的檢測 對相應的抗生素耐藥基因進行檢測發(fā)現(xiàn)，22株mcr-1陽性大腸桿菌，抗四環(huán)素類耐藥基因tetA檢出率最高，為100.00%；其次是抗氟喹諾酮類qnrA、qnrB、oqxA、oqxB、fosA3基因的檢出率分別為63.64%、27.27%、54.55%、50%和63.64%；另外，有2株攜帶抗碳氫霉烯類抗生素的blaNDM基因，9株攜帶超廣譜的β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M-9G。見表3。

2.4 質(zhì)粒類型鑒定mcr-1陽性大腸桿菌的質(zhì)粒攜帶率為100%，從23種質(zhì)粒中共鑒定出13種，分別為IncFIB、IncFIA、IncHI1、IncHI2、IncB、IncK、IncI2、IncN、IncY、IncI1、IncA/C、IncX3、IncX4。各種質(zhì)粒的攜帶率分別為：IncHI1為4.55%(1/22)，IncHI2為27.27%(6/22)，IncX3為9.09%(2/22)，IncX4為9.09%(2/22)，IncFIA為9.09%(2/22)，IncFIB為77.27%(17/22)，IncY為58.33%(7/22)，IncN為9.09%(2/22)，IncA/C為4.55%(1/22)，IncI1為22.73%(5/22)、IncK為27.27%(6/22)、IncB為13.64%(3/22)，IncI2為81.82%(18/22)。見表3。

3 討論

3.1mcr-1陽性大腸桿菌流行病學情況 本試驗于2017年10月—2018年7月對吉林省14個地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)殖場采集了動物源樣本以及環(huán)境樣本，首先分離鑒定406株大腸桿菌，從中檢測到22株mcr-1陽性大腸桿菌，雞源mcr-1陽性檢測率(5.42%)，其中動物源樣本mcr-1陽性菌檢測的陽性率為8.65%，環(huán)境樣本中水樣和土樣未檢測到mcr-1陽性菌。雖然本試驗中雞源mcr-1陽性檢測率低于Tong H等[7]報道的吉林省豬源mcr-1陽性檢測率45%，但其通過直接提取豬糞便中的基因組DNA進行檢測，經(jīng)過培養(yǎng)并未分離出mcr-1陽性菌，且不能真實反映該地區(qū)養(yǎng)殖場中mcr-1陽性菌株的實際流行情況[8]。值得注意是，空氣樣本檢測到了3株mcr-1陽性大腸桿菌，陽性率達到了25.00%，遠遠高于雞源樣本，mcr-1陽性菌可通過流動空氣在養(yǎng)殖場內(nèi)廣泛傳播。通過對本次試驗采集的mcr-1陽性菌的采集地點進行了統(tǒng)計，吉林省永吉縣的陽性檢出率最高(50.00%)，該地區(qū)的衛(wèi)生防控壓力較大，應當引起重視。

表3 22株mcr-1陽性大腸桿菌多藥耐藥基因及質(zhì)粒類型

3.2mcr-1陽性大腸桿菌的多重耐藥情況嚴重 從本試驗所檢出的mcr-1陽性率及耐藥水平(MIC為1～16 μg/mL)來看，吉林省范圍內(nèi)的多黏菌素耐藥尚處于中度水平，但是令人擔憂的問題是本次檢出的22株mcr-1陽性大腸桿菌均為多重耐藥菌，且耐藥譜較廣。所有菌株對氯霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、四環(huán)素類抗生素的耐藥率達到了100.00%，大多數(shù)菌株對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥，有4株菌甚至對亞胺培南產(chǎn)生了耐藥性。mcr-1常易與以下多種抗性基因共存介導多重耐藥，如blacTX-M、blaTEM-1、blaNDM-5、blaNDM-1、aac(6′)-Ib、floR、fosA3、oqxAB等[9-10]。多重耐藥基因的共傳播大大增加了感染的危險性。本試驗對mcr-1陽性菌的耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類耐藥基因tetA檢出率最高(100%)；此外，廣譜的氟喹諾酮類抗生素的耐藥基因檢出率也較高，以oqxA、oqxB、qnrA為主。值得注意的是，有9株mcr-1陽性大腸桿菌攜帶超廣譜β內(nèi)酰胺酶blaCTX-M-9G，其中的2株mcr-1陽性菌(LT5-2和LT6)同時攜帶mcr-1、blaNDM和blaCTX-M-9G，這2株菌都是在同一地區(qū)的養(yǎng)殖場采集的健康雞的肛門拭子分離得到的，這些多重耐藥菌株一旦廣泛傳播，被感染的人畜將陷入“無藥可用”的境地，必須引起足夠的重視。

3.3 質(zhì)粒類型的復雜性與多重耐藥密切相關 本試驗在22株mcr-1陽性大腸桿菌中共檢測到13種類型質(zhì)粒，其中IncI2和IncFIB陽性率較高，分別為81.82%和77.27%；IncK、IncY、IncI1、IncHI2陽性率稍低，分別為27.27%，58.33%，22.73%，27.27%；IncHI1、IncX3、IncX4、IncFIA、IncN、IncA/C、IncB陽性率最低，分別為4.55%，9.09%，9.09%，9.09%，9.09%，4.55%，13.64%。IncI2、IncHI2、IncX4是近年來報道較多的與mcr-1傳播密切相關的質(zhì)粒[11]，IncI2和IncX4還與倍受關注的多種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及碳氫酶烯酶密切相關，如blaKPC[12]，blaCTX-M[13-14]，blaCMY-2[15]。IncY 質(zhì)粒常攜帶廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M-15，有關于其攜帶mcr-1的報道較少，IncI1也常常被報道與廣譜β-內(nèi)酰胺酶的存在有關，并且可以與攜帶mcr-1的IncI2共同存在于同一株大腸桿菌中[16]。本試驗中有5株mcr-1陽性菌中同時含有IncI1質(zhì)粒，使菌株同時對喹諾酮類抗生素、β-內(nèi)酰胺類抗生素和多黏菌素耐藥，一旦感染將大大增加治療的難度。

綜上所述，吉林省雞源大腸桿菌多重耐藥情況嚴重，質(zhì)粒類型和傳播途徑復雜，部分mcr-1陽性大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，這些多黏菌素耐藥菌的潛在危害性不容小覷。雖然我國已經(jīng)在禽畜飼養(yǎng)過程中限制使用多黏菌素類抗菌藥物，但是mcr-1的攜帶率仍然較高，這可能是由于以下原因造成：(1)在限制多黏菌素使用之前已經(jīng)產(chǎn)生該藥物的耐藥菌；(2)環(huán)境中的多黏菌素耐藥菌將mcr-1通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移給了養(yǎng)殖場中的敏感菌；(3)多黏菌素使用的監(jiān)管不力，濫用情況嚴重。因此，應當在食源動物和人群中進行多黏菌素耐藥篩查，并評估對人類健康的風險。除了加強臨床監(jiān)管與檢測外，也同時應當重視畜牧養(yǎng)殖業(yè)的藥物監(jiān)管，定期監(jiān)測，警惕多藥耐藥菌株的廣泛傳播。