ODAH Kokou Ayefounin，董文龍，ATIAH Luke Atiewin，劉 磊，王一鳴，賈博巖，孔令聰，高云航，馬紅霞

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

1999年，Angen等根據(jù)菌種的表型及其基因特性將溶血曼氏桿菌，Mannheimiaglucosida,Mannheimiaruminalis,Mannheimiagranulomatis，Mannheimiacaviae,Mannheimiavarigena共6種菌歸類為新的曼氏桿菌屬[1]。Mannheimiavarigena是存在于多種反芻動物的上呼吸道及腸道的正常菌群，當(dāng)動物機體抵抗力低下時，也可引起牛的肺炎及乳腺炎等[2-3]。目前鮮有關(guān)于該菌致病性及耐藥性的報道。本試驗從吉林省某牛場病死牛的肺臟內(nèi)分離到1株Mannheimiavarigena，為進(jìn)一步了解這種病原特性，對其各種生物學(xué)特性、所導(dǎo)致的病理學(xué)變化及耐藥表型進(jìn)行初步研究，試驗數(shù)據(jù)為該菌致病機制及耐藥機制的深入研究提供科學(xué)依據(jù)，同時也為臨床治療該菌所引起的疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 吉林省某牛場，1例病死牛，無菌采集肺臟送檢，進(jìn)行病原菌的實驗室分離培養(yǎng)。

1.2 試劑及培養(yǎng)基 TSA固體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氟苯尼考等10種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，均購自中國食品藥品檢定研究院。細(xì)菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。10× Buffer、dNTP、ExTaqDNA聚合酶、切膠回收試劑盒、pMD18-T載體及E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離與純化 在采集的牛肺臟表面用剪刀燙出一處無菌表面，無菌手術(shù)刀沿著無菌面切入，用接種環(huán)伸入刀口沾取病灶黏液，接種于TSA平板(含5%胎牛血清)上，37 ℃需氧培養(yǎng)12 h后進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至鏡檢細(xì)菌形態(tài)均一為止，將純化獲得的菌株命名為Mv-1。單一Mv-1菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)中增殖培養(yǎng)備用。

1.4 染色鏡檢 挑取平板上已純化的單個菌落，生理鹽水稀釋，酒精燈火焰上加熱固定，進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5 生化試驗 對分離純化后的菌株進(jìn)行木糖醇、甘露醇、吲哚等一系列生化試驗，試驗結(jié)果參照Boora等[4]所報道的試驗結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.6 動物致病性試驗 在前期預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，采用平板計數(shù)法將菌懸液濃度分別調(diào)節(jié)至2×109、2×108、 2×107、2×106CFU/mL和2×105CFU/mL。試驗組中將5個不同稀釋度菌懸液腹腔接種于健康昆明小鼠，0.15 mL/只；對照組腹腔接種無菌TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)，0.15 mL/只，隔離飼喂。接種后每隔6 h觀察1次小鼠臨床表現(xiàn)，連續(xù)觀察7 d。剖檢死亡小鼠，觀察各臟器的病變并分離臟器內(nèi)細(xì)菌。根據(jù)每組小鼠死亡數(shù)量應(yīng)用改良寇氏法計算出分離菌株的半數(shù)致死量(LD50)。

1.7 分離菌株16S rRNA PCR及序列測定 取1.5 mL增殖菌液12 000 r/min離心10 min，棄上清，保留菌體沉淀，按照細(xì)菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒說明書提取DNA，作為16S rRNA PCR擴增模版。

參照Moreno等[5]報道由生物公司合成16S rRNA細(xì)菌鑒定通用引物。上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。按照反應(yīng)體系進(jìn)行16S rRNA PCR加樣，總體系25 μL，其中DNA模板、上游與下游引物各加1 μL， 10×ExTaqBuffer和dNTP Mixture各加 2 μL，ExTaq0.3 μL，最后加16.7 μL ddH2O。16S rRNA基因擴增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

根據(jù)膠回收試劑盒說明書指導(dǎo)方法，對目的條帶切膠回收，與pMD18-T克隆載體16 ℃連接3 h，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取100 μL均勻涂布于LB平板(含100 μg/mL氨芐青霉素)37 ℃培養(yǎng)12 h,挑取陽性菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg/mL氨芐青霉素)37 ℃搖床增殖培養(yǎng)，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測。陽性克隆質(zhì)粒送生工生物工程(長春)股份有限公司測序。登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，將測序結(jié)果與已知的相關(guān)核酸序列進(jìn)行Blast比對分析。

1.8 藥敏試驗 本試驗選用氟苯尼考、強力霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、大觀霉素、鏈霉素、新霉素、克林霉素、紅霉素及頭孢曲松臨床常用的10種藥物，采用平板稀釋法對分離株Mv-1進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)的測定。

1.9 病理組織學(xué)觀察 將存在明顯病理變化的肺臟組織浸泡于10%福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，制作石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 病變肺臟采集細(xì)菌接種于TSA(含5%胎牛血清)平板，37 ℃需氧恒溫培養(yǎng)12 h，純化培養(yǎng)后菌落形態(tài)較均一，菌落表面光滑，呈圓形，略凸起(圖1)。染色鏡檢為革蘭陰性，形態(tài)均一的短桿菌(圖2)。

圖1 Mv-1菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Mv-1

圖2 Mv-1革蘭陰性染色結(jié)果Fig.2 Gram negative staining results of Mv-1

2.2 生理生化試驗 記錄生理生化試驗結(jié)果，參照Boora等[4]所報道的試驗結(jié)果進(jìn)行比對分析，Mv-1生理生化特性與Mannheimiavarigena生理生化特性基本一致(表1)。

表1 Mv-1生理生化特性Table 1 The physiological and biochemical characteristics of Mv-1

2.3 動物致病性試驗 試驗組小鼠在注射病原菌24 h后，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)病癥，表現(xiàn)為精神沉郁、蜷縮成團、被毛凌亂，剖檢死亡小鼠，肺臟病變明顯，局部伴有壞死灶；心外膜有少量出血點；腸道未見明顯病變。對照組小鼠健活，無任何異常。無菌采集病死小鼠的肺臟，分離培養(yǎng)肺臟中的細(xì)菌，純化后鏡檢結(jié)果與供試菌株極為相似，對小鼠肺臟分離株進(jìn)行16S rRNA基因測序，Blast比對分析，結(jié)果表明，試驗組死亡小鼠肺臟中分離到細(xì)菌與供試菌株一致，證明分離菌株為一種致病菌。根據(jù)每組小鼠死亡數(shù)量，計算該菌株對小鼠的LD50為1×108CFU/只(表2)。

表2 Mv-1對小鼠的致病性Table 2 Pathogenictiy of Mv-1 in mice (只)

2.4 分離菌株16S rRNA PCR及測序 按照16S rRNA基因擴增反應(yīng)體系及條件進(jìn)行PCR擴增，16S rRNA PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，成功擴增出1 500 bp左右的目的條帶(圖3)。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析比對，與已上傳的Mannheimiavarigena(GenBank:CP006943.1)同源性為98%。

圖3 16S rRNA PCR擴增結(jié)果Fig.3 Amplification results of 16S rRNA PCRM:DL-2 000 maker; A,B:Mv-1 16S rRNA PCR產(chǎn)物M:DL-2 000 maker; A,B:16S rRNA PCR production of Mv-1

2.5 藥敏試驗 分離菌株對氟苯尼考、克林霉素及頭孢曲松敏感，對強力霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、大觀霉素、鏈霉素、新霉素及紅霉素耐藥(表3)。

表3 分離株藥敏試驗Table 3 Durg sensitivity test results of isolates

2.6 病理組織學(xué)觀察 取新鮮的病變肺臟組織，浸泡于10%福爾馬林溶液中固定，制作石蠟切片，顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化，可見大量中性炎性細(xì)胞(見封二彩版圖4箭頭A)，肺泡壁毛細(xì)血管擴張充血，肺泡壁增寬(見封二彩版圖5箭頭B)，呈支氣管肺炎癥狀。

圖4 病變牛肺臟 (100×)Fig.4 Diseased bovine lungs (100×)

圖5 病變牛肺臟 (400×)Fig.5 Diseased bovine lungs(400×)

3 討論

巴斯德菌科菌株能夠引起多種重要經(jīng)濟動物的多樣疾病，曼氏桿菌屬作為巴斯德菌科的重要組成部分，關(guān)于曼氏桿菌屬疾病的病例報告逐年增多。國內(nèi)獸醫(yī)臨床上關(guān)于曼氏桿菌屬的病例報告主要集中于溶血曼氏桿菌感染所引發(fā)的疾病，而關(guān)于Mannheimiavarigena的相關(guān)研究甚少。

牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)，由感染呼吸道的支原體、甲型流感病毒、牛巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、牛皰疹病毒I型等其中單獨一種病原或者幾種病原混合而引起，對養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展具有嚴(yán)重的危害[6-8]。本試驗在死亡牛肺臟中分離到1株革蘭陰性短桿菌，通過對分離菌株16S rRNA基因的序列測定并結(jié)合菌株的形態(tài)特征和生化特性綜合分析后，鑒定分離菌株為Mannheimiavarigena。該菌能夠引起反芻動物和豬的多種疾病，主要包括肺炎、乳腺炎、腸炎和敗血癥[9-10]。雖然鮮有關(guān)于Mannheimiavarigena引起牛呼吸道疾病的病例，但是不可忽視其在獸醫(yī)臨床上的潛在危害。小鼠致病性試驗結(jié)果顯示，Mv-1對小鼠有較強的致病性，但是關(guān)于Mannheimiavarigena毒力的研究尚未起步，其致病機制還有待進(jìn)一步的研究。

抗生素的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用造福于全人類，各種抗生素的出現(xiàn)大幅降低了細(xì)菌性疾病的發(fā)病率和死亡率。但是，抗生素在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)及食品等領(lǐng)域的不合理使用，導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生的耐藥水平也不斷提高[11-12]。Mv-1的MIC藥敏試驗結(jié)果表明：其對四環(huán)素類、喹諾酮類、氨基糖苷類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有較強耐藥性，分離株表現(xiàn)為多重耐藥可能與其攜帶的耐藥性基因等其他耐藥機制有關(guān)。Mv-1 對氟苯尼考、克林霉素及頭孢曲松敏感，因此，臨床可根據(jù)實際情況科學(xué)的選用敏感藥物治療該菌株引起的疾病。