田萬年，王妍慧，薛書江，賈立軍，張守發(fā)

(1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101 ； 2. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴貝斯蟲病(Babesiaovata)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲寄生于牛紅細胞內(nèi)所引起的寄生蟲病[1]。病牛多表現(xiàn)為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿，多引起死亡[2-3]。我國于1986年在河南省盧氏縣牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)本病，隨后1994年，在甘肅張家川回族自治縣牛體內(nèi)分離到卵形巴貝斯蟲[4]。目前牛卵形巴貝斯蟲的診斷主要通過血液涂片，顯微鏡檢查為主，隱性感染牛的血液染蟲率較低，顯微鏡檢測易出現(xiàn)漏檢和誤診。因此，急需建立一種敏感性高、特異性強，用于該病早期診斷。PCR方法是一種快速、敏感、特異的診斷方法，已廣泛應(yīng)用寄生蟲病的診斷[5-6]。二溫式PCR方法比常規(guī)PCR方法特異性更強，所需時間更少[7]。目前尚未見應(yīng)用二溫式PCR診斷牛卵形巴貝斯蟲病的文獻報道。本試驗根據(jù)卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因序列設(shè)計1對引物，建立了二溫式PCR方法，為今后牛卵形巴貝斯蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 血液樣本采自吉林省琿春地區(qū)散養(yǎng)的延邊黃牛60份，無菌采集抗凝血，用PBS洗3次。存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r制作了血液涂片，甲醛固定保存，供染色鏡檢。牛巴貝斯和雙芽巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)玄學(xué)南教授惠贈。瑟氏泰勒蟲基因組DNA由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 PCR診斷方法的建立

1.3.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因(LC125457)，利用Primer Premier 5.0軟件在保守區(qū)設(shè)計了1對二溫式PCR引物，引物P1：5′-TAGTTCTTAACCGACTTTC-TCG-3′，P2：5′-TTCTCAAGTAAAAATAGGCCC-3′，擴增預(yù)期片段大小為464 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.2 牛卵形巴貝斯蟲DNA標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 將經(jīng)姬姆薩染色后顯微鏡檢查確診為牛卵形巴貝斯蟲感染的抗凝血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，抽提的DNA用50 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴增及退火-延伸溫度的篩選 以提取的卵形巴貝斯蟲DNA為模板，PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火-延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。退火-延伸溫度梯度為 58～64 ℃。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的鑒定 將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司序列測定。

1.3.5 特異性試驗 以卵形巴貝斯蟲基因組DNA為試驗樣本，以牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為對照樣本，進行二溫式和普通PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.3.6 敏感性試驗 用紫外分光光度計測定已提取的卵形巴貝斯蟲DNA的OD260 nm值，計算DNA含量。以10倍為梯度進行連續(xù)稀釋成7個不同濃度，按照最適退火-延伸溫度進行二溫式和普通PCR擴增，對比其敏感性。

1.4 臨床樣本的檢測試驗 應(yīng)用所建立的二溫式PCR方法對采自吉林省琿春地區(qū)的60份血液樣品進行檢測。同時，與常規(guī)PCR和血液涂片鏡檢相對比，比較陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增 對卵形巴貝斯蟲基因組DNA進行PCR擴增后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)464 bp的特異性DNA條帶(見圖1)，與預(yù)期的片段大小相一致。

圖1 卵形巴貝斯蟲PCR擴增結(jié)果Fig. 1 PCR amplication result of Babesia ovataM：DL-2 000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)； 1：卵形巴貝斯蟲DNA樣本； 2：空白對照M：DL-2 000 DNA marker； 1：Babesia ovata DNA； 2：Blank control

2.2 測序與序列比較 將PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，結(jié)果表明，其核苷酸序列與GenBank上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因序列(LC125457)同源性為 99.9%。

2.3 退火-延伸溫度的篩選 退火-延伸溫度梯度為58～64 ℃。其中，60 ℃時目的條帶最亮，因此，最佳退火-延伸溫度為60 ℃(見圖2)。

圖2 退火-延伸溫度的篩選試驗Fig. 2 Screening test for annealing-extension temperatureM：DL-2 000 DNA標(biāo)準(zhǔn)； 1：58 ℃； 2：59 ℃； 3：60 ℃； 4：61 ℃； 5：62 ℃； 6：63 ℃； 7：64 ℃M：DL-2 000 DNA marker； 1：58 ℃； 2：59 ℃； 3：60 ℃； 4：61 ℃； 5：62 ℃； 6：63 ℃； 7：64 ℃

2.4 特異性試驗 以牛卵形巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板，分別用二溫式和三步法進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳結(jié)果顯示，僅牛卵形巴貝斯蟲DNA樣本擴增后出現(xiàn)特異性DNA條帶，與預(yù)期片段大小相符，而作為對照樣本的牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA均無此擴增條帶出現(xiàn)(見圖3)。

圖3 特異性試驗結(jié)果Fig. 3 The results of specific testM：DL-2 000 DNA標(biāo)準(zhǔn)； 1：卵形巴貝斯蟲； 2：雙芽巴貝斯蟲； 3：牛巴貝斯蟲； 4：瑟氏泰勒蟲M：DL-2 000 DNA marker； 1：Babesia ovata； 2：Babesia bigemina； 3：Babesia bovis； 4：Theileria sergenti

2.5 敏感性試驗 根據(jù)DNA分光光度法測定陽性模板DNA濃度為1.6×106fg/μL。將所取的DNA依次做10倍梯度稀釋，分別進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖4)。當(dāng)DNA含量為16 fg/μL時，也能擴增出特異目的條帶。

圖4 敏感性試驗結(jié)果Fig. 4 The results of sensitivity experimentM：DL-2 000 DNA標(biāo)準(zhǔn)； 1～8：1.6×106～0.16 fg/μL的PCR擴增產(chǎn)物M：DL-2 000 DNA marker； 1～8：PCR amplification products of 1.6×106～0.16 fg/μL

2.6 臨床樣本檢測 對采自吉林省琿春地區(qū)60份血液樣本分別進行二溫式PCR方法、普通PCR和血液涂片檢測。二溫式PCR和普通PCR方法的陽性率均為30%(18/60)，2個檢測方法檢出結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，而血涂片陽性率為11.67%(7/60)，且血液涂片鏡檢診斷為陽性的樣本經(jīng)二溫式PCR診斷均為陽性，表明二溫式PCR方法更為敏感。

3 討論

卵形巴貝斯蟲是牛梨形蟲病最為重要的蟲種，嚴重制約養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，急需建立一種快速的檢測方法。目前卵形巴貝斯蟲病PCR診斷方法目的基因為AMA-1和CCTη基因[8-9]。據(jù)報道，18S rRNA基因在梨形蟲不同蟲種間變異較大，但在同一蟲種間具有較好的保守區(qū)域，是PCR診斷首選目的基因[10-11]。因此本試驗以卵形巴貝斯蟲的18S rRNA為目的基因，設(shè)計特異性引物，建立了卵形巴貝斯蟲二溫式PCR診斷方法，特異性試驗表明，該引物只能擴增出卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因片段，而不能擴增出瑟氏泰勒蟲、巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲基因組DNA，對該地區(qū)卵形巴貝斯蟲病的臨床診斷方面具有一定的應(yīng)用價值。

本試驗對所建立的二溫式PCR各反應(yīng)體系進行優(yōu)化，比常規(guī)PCR退火溫度要高，提高了檢測特異性，PCR擴增時間明顯縮短，提高了該病的診斷效率。對60份血液樣本進行PCR檢測，陽性率為30%(18/60)，而血液涂片染色鏡檢出的陽性率為11.67%(7/60)，二者檢測的陽性符合率為100%。本試驗所建立的二溫式PCR方法為基層獸醫(yī)部門對卵形巴貝斯蟲病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種有效的檢測方法。