張丁華，王艷豐，陳海燕，劉守鉉，李愛心

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院，河南 中牟 451450)

豬大腸桿菌病是由某些血清型的致病性大腸桿菌引起的一種腸道傳染病，主要侵害初生至斷奶仔豬，發(fā)病率和死亡率較高，集約化飼養(yǎng)、提前斷奶、產(chǎn)房管理等不利因素加劇了該病的嚴(yán)重性。目前，該病治療以抗生素為主，大量研究表明，不同地區(qū)大腸桿菌耐藥基因類型多而復(fù)雜,耐藥性嚴(yán)重并存在多重耐藥性。中藥具有多種營養(yǎng)成分和生物活性，兼有營養(yǎng)物質(zhì)和藥物的兩重性，既能促進(jìn)畜禽生長、提高生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品質(zhì)量，又能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力。研究表明，中藥可以抑制大腸桿菌[1]，同時(shí)與抗菌藥物聯(lián)用可以抑制大腸桿菌的耐藥性，延緩耐藥性的產(chǎn)生[2]。本試驗(yàn)通過人工誘發(fā)豬大腸桿菌病，觀察中藥復(fù)方“瀉痢康”對斷奶仔豬腹瀉的療效及免疫功能影響，為開發(fā)抗豬大腸桿菌性腹瀉中藥制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 DNM-9606酶標(biāo)分析儀，購自北京普朗新技術(shù)有限公司；DK-8D智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自江蘇金怡儀器科技有限公司；L600離心機(jī)，購自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Alpha1500紫外可見分光光度計(jì)，購自上海譜元儀器有限公司；RT-9200半自動(dòng)生化分析儀，購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 藥物及試劑 澤漆、馬齒莧、楊樹花、白頭翁、女貞子、黃芪、柴胡共7味中藥(命名為瀉痢康)，購自中牟縣醫(yī)藥公司；硫酸慶大霉素注射液，購自上海申亞動(dòng)物保健品有限公司(5 mL∶0.2 g)；豬免疫球蛋白IgG、IgA、IgM測定試劑盒(含量采用免疫比濁法測定)，均購自北京華英生物技術(shù)研究所；總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所有限公司；常規(guī)試劑及儀器由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 菌種 豬致病性大腸桿菌O101，由河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物疫病快速診斷中心分離、鑒定、保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用日齡相同(30日齡)、體重相近(7.41±0.12) kg的健康杜長大三元仔豬80頭。每組單獨(dú)給料飼喂，仔豬自由采食、飲水。免疫程序：20、60日齡各免疫1次豬瘟活疫苗(脾淋苗)，45日齡 免疫偽狂犬病活疫苗，75、90、125日齡各免疫1次豬口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活苗。

1.5 菌液制備 將保存的豬致病性大腸桿菌O101接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后選擇典型菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h后，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，將菌液稀釋至濁度為1×1010CFU/mL。經(jīng)感染細(xì)菌劑量測定，確定攻毒劑量為6×108CFU/mL。

1.6 中藥煎劑 澤漆、馬齒莧、楊樹花、白頭翁、女貞子、黃芪、柴胡按一定比例混合，加水浸泡1 h，再加10倍量水煎煮2次，過濾，合并2次煎煮液，濃縮至每1 mL含原生藥1 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將80頭斷奶仔豬隨機(jī)分為4組：Ⅰ組(正常組)、Ⅱ組(感染不治療組)、Ⅲ組(感染西藥治療組)和Ⅳ組(感染瀉痢康治療組)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭。設(shè)計(jì)如下：Ⅰ組：灌服生理鹽水，每天2 mL/頭，1次/d，連用7 d；Ⅱ組：灌服大腸桿菌液，每天2 mL/頭； Ⅲ組：先灌服大腸桿菌液，每天2 mL/頭，同日肌肉注射慶大霉素，4 mg/(kg·bw)，2 次/d，連用3 d；Ⅳ組：先灌服大腸桿菌液，每天2 mL/頭，同日灌服瀉痢康溶液，10 mL/頭，分2次灌服，1次/d，連用7 d。

每天觀察各組仔豬精神狀況、采食量及糞便性狀等，逐頭檢查肛門是否紅腫和有無糞便污染，若仔豬肛門紅腫 (或被糞便污染)，則視為腹瀉，并根據(jù)糞便形狀按仔豬腹瀉評分標(biāo)準(zhǔn)[3](見表1)，做好記錄，計(jì)算仔豬的腹瀉率、腹瀉頻率和腹瀉指數(shù)[4]。

腹瀉率=腹瀉頭數(shù)/總頭數(shù)×100%；腹瀉頻率=Σ(腹瀉仔豬頭數(shù)×仔豬腹瀉天數(shù))/(試驗(yàn)仔豬頭數(shù)×正試期天數(shù))×100%；腹瀉指數(shù)=試驗(yàn)天數(shù)內(nèi)供試試驗(yàn)豬糞便狀況評分之和/供試驗(yàn)豬總頭數(shù)。

表1 腹瀉狀況評分標(biāo)準(zhǔn)[3]Table 1 Evaluation standard of diarrhea situation

1.8 血清生化和免疫指標(biāo)檢測 試驗(yàn)第1天、第7天、第14天，每組隨機(jī)抽取5頭仔豬，空腹前腔靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心5 min制備血清，-20 ℃ 保存?zhèn)溆?。用ELISA試劑盒檢測血清中IgA、IgG、IgM和TP、ALB、GLB的含量，其操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)均按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 瀉痢康對斷奶仔豬腹瀉的治療效果及影響 見表2、表3。由表2可知，人工感染豬大腸桿菌后Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組仔豬均出現(xiàn)腹瀉，經(jīng)Ⅲ組、Ⅳ組治療的仔豬死亡率明顯低于Ⅱ組，表明Ⅳ組(瀉痢康)能夠有效治療仔豬大腸桿菌病，并且治療效果與Ⅲ組(慶大霉素)相當(dāng)，保護(hù)率達(dá)到70.0%。由表3可知，Ⅰ組仔豬糞便無異常，無腹瀉發(fā)生，精神、飲食均正常。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組大腸桿菌感染24 h后，仔豬陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象。其中以Ⅱ組最為嚴(yán)重，仔豬精神沉郁，食欲減退，糞便稀溏，肛門周圍有糞便污染，試驗(yàn)第7天與Ⅰ組仔豬相比，體重減少8.4%，差異極顯著(P<0.01)，腹瀉率達(dá)100%，腹瀉指數(shù)為2.8。Ⅲ組、Ⅳ組仔豬腹瀉分別經(jīng)慶大霉素、瀉痢康治療后，腹瀉程度明顯減輕，糞便基本成形，腹瀉率和腹瀉指數(shù)分別為36.8%、35.5%和1.8、1.3。試驗(yàn)第1天體重，4組差異不顯著(P>0.05)；第7天體重，Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅳ組與Ⅱ組相比差異極顯著(P<0.01)，Ⅲ組、Ⅳ組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 各組對人工誘發(fā)豬大腸桿菌病的治療結(jié)果Table 2 Treatment results of each group on artificially induced swine colibacillosis

表3 瀉痢康對斷奶仔豬腹瀉的影響Table 3 The effect of Xielikang on diarrhea of weaned piglets

2.2 瀉痢康對腹瀉斷奶仔豬血清中TP、ALB、GLB 含量的影響 見表4。由表4可知，試驗(yàn)第1天，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組血清中 TP、ALB、GLB含量差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)第7天，血清中TP含量，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與Ⅰ組相比分別降低5.1%、3.3%和3.1%，差異均不顯著(P>0.05)，Ⅳ組與Ⅱ組、Ⅲ組相比分別升高2.1%、2.8%，差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)第14天，Ⅱ組與Ⅰ組相比降低9.7%，差異顯著(P<0.05)，Ⅲ組與Ⅰ組相比降低5.0%，差異顯著(P<0.05)，Ⅳ組與Ⅰ組相比降低2.1%，差異不顯著(P>0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組之間差異不顯著(P>0.05)。血清中GLB含量在試驗(yàn)第7天，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與Ⅰ組相比，分別降低11.9%、9.0%和6.7%，差異顯著(P<0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組之間差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)第14天，Ⅳ組與Ⅰ組相比差異不顯著(P>0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組之間差異不顯著(P>0.05)。血清中ALB含量，試驗(yàn)第1、7、14天，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組均低于Ⅰ組，Ⅳ組高于Ⅱ組、Ⅲ組，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 瀉痢康對腹瀉斷奶仔豬血清中 TP、ALB、GLB 含量的影響Table 4 The effect of Xielikang on the content of TP,ALB and GLB in the serum of weaned piglets with diarrhea (g/L)

2.3 瀉痢康對腹瀉斷奶仔豬血清中IgG、IgM、IgA含量的影響 見表5。由表5可知，試驗(yàn)第7天、第14天，Ⅳ組仔豬血清IgA含量高于Ⅱ組、Ⅲ組，差異不顯著(P>0.05)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組腹瀉仔豬血清中IgG的水平與Ⅰ組相比下降，差異顯著(P<0.05)， Ⅳ組仔豬血清中IgG的水平與Ⅲ組和Ⅱ組相比升高快，但差異不顯著(P>0.05)。Ⅳ組仔豬血清IgM含量高于Ⅱ組、Ⅲ組，差異不顯著(P>0.05)。

表5 瀉痢康對腹瀉斷奶仔豬血清IgG、IgM、IgA 含量的影響Table 5 The effect of Xielikang on the serum IgG,IgM and IgA levels of weaned piglets with diarrhea (mg/mL)

3 討論

研究表明，澤漆具有保肝、抗氧化損傷、抗炎、抗補(bǔ)體等作用，對大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用。馬齒莧具有抗菌消炎、降血脂、降血糖和提高免疫力的功效，對大腸桿菌抑菌作用較強(qiáng)。楊樹花具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、增強(qiáng)免疫力等多種功效，對大腸桿菌具有抑制作用，且隨藥物濃度升高而增強(qiáng)。白頭翁對大腸桿菌殺菌作用較強(qiáng)，能清除毒素、抑制腸運(yùn)動(dòng)等。女貞子具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑菌抗炎等作用，對大腸桿菌等有明顯的抑制作用，能顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。黃芪常用作免疫增強(qiáng)劑。柴胡具有抗炎、退熱、抗菌、抗病毒作用。諸藥合用，共奏清熱解毒、涼血止痢之功效。試驗(yàn)結(jié)果顯示，瀉痢康與慶大霉素療效相比無顯著性差異，表明瀉痢康具有一定治療仔豬腹瀉的作用，療效與抗生素作用基本相當(dāng)。

血清生化指標(biāo)是評估機(jī)體代謝及健康狀況的重要指標(biāo)，TP、ALB及GLB水平是反映機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要指標(biāo)，其中TP是評價(jià)動(dòng)物代謝和免疫功能的重要指標(biāo)之一，ALB與體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，GLB與免疫功能有關(guān)。陳暢[5]研究表明，在斷奶仔豬日糧中添加由藿香、紫蘇、白芷、厚樸等組成的中藥復(fù)方，能顯著提高TP、ALB、GLB的含量；周亞軍[6]研究也表明，金銀花、黃芪等組成的中藥復(fù)方，可以顯著提高TP、ALB、GLB的含量。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，治療后的第7天、第14天，Ⅳ組仔豬血清中TP、ALB、GLB含量均高于Ⅱ組、Ⅲ組，與上述試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明瀉痢康能促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)主要營養(yǎng)物質(zhì)的分解和吸收，促進(jìn)肝臟中TP、GLB和ALB的合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和代謝，改善機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收，提高動(dòng)物的免疫功能。但與張賽奇[7]研究結(jié)果不一致，后者發(fā)現(xiàn)葛芪復(fù)方對仔豬大腸桿菌性腹瀉有較好療效，但血清中TP與空白組無顯著差異，僅GLB、ALB顯著高于空白對照組。究竟是何原因，是否與中藥配伍、樣本數(shù)量、感染程度、用藥時(shí)間等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

免疫球蛋白是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，其中IgA、IgM、IgG是動(dòng)物體內(nèi)主要的免疫球蛋白，其在血清中的濃度可衡量機(jī)體的免疫功能。IgA對機(jī)體呼吸道、消化道等局部黏膜免疫起著相當(dāng)重要的作用，具有抗菌、抗病毒、抗毒素作用，IgM是機(jī)體初次接觸抗原物質(zhì)最早產(chǎn)生的抗體，與IgA、IgG均具有抗菌、抗毒素和抗病毒作用[8]。袁威等[9]研究表明，斷奶仔豬日糧添加“豬康散”能明顯提高血清中IgG、IgM、IgA的含量，提高體液免疫功能；閻貞陶[10]亦報(bào)道，復(fù)方中藥治療感染腸致病性大腸桿菌(EPEC)的小鼠后，小鼠癥狀有不同程度減輕，IgA、IgG和IgM水平均升高；但楊云喬等[8]報(bào)道，復(fù)方中藥治療豬流行性腹瀉，中藥治療組和西藥組對照組IgM含量均比治療前顯著升高，中藥組與治療前相比IgA、IgG表達(dá)減少。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，瀉痢康可以提高血清中IgA的含量且高于Ⅱ組、Ⅲ組，但差異不顯著；用中藥治療的血清中IgG的水平與用西藥治療和未治療的相比升高快，但差異不顯著，各組血清中IgM的含量也無顯著變化。與上述試驗(yàn)結(jié)果不一致，是否與動(dòng)物種類、健康狀況、疾病類別、中藥配伍、樣本數(shù)量、用藥時(shí)間等因素有關(guān)，亦有待于今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，瀉痢康不僅可用于防治豬大腸桿菌病，而且還可提高仔豬血清生化指標(biāo)(TP、ALB、GLB)和血清免疫指標(biāo)(IgG)水平，可以用于治療仔豬大腸桿菌病。