朱磊, 郭鴻, 井高靜, 帥佃奎, 熊懷玉, 黃薔茹, 劉健*

(蘭州大學(xué) 第一醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)科, 2.內(nèi)分泌科. 甘肅 蘭州 730030)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是肺部過度炎癥反應(yīng)引起的疾病，發(fā)病特征為急性發(fā)作非心源性肺水腫、雙側(cè)肺浸潤和呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性降低，臨床表現(xiàn)為難治性低氧血癥，死亡率高[1]，嚴(yán)重威脅患者的生命安全，一直是科研工作者重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域.但是由于ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病理機(jī)制認(rèn)識不足、新的治療方法發(fā)展受阻等原因，臨床上仍然無法取得滿意的治療效果[2].因此，探索新藥及其作用機(jī)制對臨床治療ARDS有重要的意義.

阿米洛利目前在臨床主要治療心力衰竭、肝硬化和慢性腎炎等引起的頑固性水腫或腹水，其主要作用于腎小管遠(yuǎn)端，阻斷鈉-鉀交換機(jī)制，促使鈉氯排泄，同時減少鉀、氫離子分泌，具有抗炎和抗氧化的作用[3-4].有研究顯示，阿米洛利在心肌缺血再灌注損傷中具有抗細(xì)胞凋亡的作用[5]，而細(xì)胞過度凋亡可引起肺組織損傷[6].有學(xué)者發(fā)現(xiàn)阿米洛利可以緩解大鼠肺缺血再灌注的癥狀[7]，但在ARDS致肺損傷中是否有治療作用目前沒有相關(guān)研究印證.基于此，本課題組擬建立油酸誘導(dǎo)型ARDS大鼠模型，以探討阿米洛利對ARDS大鼠肺損傷的治療作用，以及PI3K/AKT信號通路在其中的作用，從而為ARDS的治療提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠，96只，體質(zhì)量為 180～200 g，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，均為合格實(shí)驗(yàn)動物(批號：0000894)，本研究得到蘭州大學(xué)第一醫(yī)院動物倫理批準(zhǔn)(批號：LDYYLL2019-137).

1.2 試劑與儀器

阿米洛利、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；羊多克隆抗體IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和白介素-10(interleukin-10，IL-10) Elisa試劑盒購自酶聯(lián)生物；預(yù)染Marker購自美國Thermo公司；牛血清白蛋白、甘氨酸、β-actin、Tris、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液均購自密理博(Millipore)中國有限公司；PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT抗體購于Genetex公司，GAPDH抗體購于Immunoway 公司，p-PI3K抗體購于Abcam公司；Tween-20上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、熒光定試劑盒均購自上海翊圣生物科技有限公司.

Western blot轉(zhuǎn)膜儀(北京六一，DYCZ-40G)、Western blot電泳儀(美國Bio-rad公司，Powerpac Universal)；NanoDrop核酸濃度測量儀(美國Thermo公司，ND-ONE-W)；實(shí)時定量PCR儀(美國ABI，StepOne Plus).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及ARDS大鼠模型建立

雄性Wistar大鼠96只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將其隨機(jī)分為4組：空白對照組(n=24)、DMSO組(n=24)、ARDS組(n=24)、阿米洛利組(n=24).

大鼠稱量體質(zhì)量后，每千克大鼠體質(zhì)量腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛350 mg進(jìn)行麻醉，將穿刺部位毛剔除，碘伏、乙醇棉球局部消毒，在一側(cè)腹股溝韌帶處作一縱切口后分別分離股動脈、股靜脈，將股靜脈置管穿刺進(jìn)入股靜脈.

空白對照組大鼠用微量進(jìn)樣器鏈接股靜脈置管后緩慢注入相應(yīng)體積的生理鹽水(每千克體質(zhì)量注射生理鹽水1.0 mL).

DMSO組由股靜脈緩慢注入相應(yīng)換算體積DMSO(每千克體質(zhì)量注射DMSO溶液0.1 mL)，30 min后再緩慢注入同空白對照組相同體積的生理鹽水.

ARDS組由股靜脈先緩慢注入相應(yīng)換算體積的油酸(每千克體質(zhì)量注射油酸0.1 mL)，再緩慢注入同空白對照組相同體積的生理鹽水.給藥后3 min左右，觀察大鼠一般情況，若出現(xiàn)呼吸頻率增快、呼吸費(fèi)力、活動減少、毛發(fā)直立、嘴唇、顏面紫紺等提示動物ARDS模型成功[8].

阿米洛利組由股靜脈緩慢注入油酸(每千克體質(zhì)量注射油酸0.1 mL)，觀察大鼠一般情況，30 min后緩慢注入阿米洛利(將4.8 mg 阿米洛利溶解于2.4 mL DMSO溶液中，然后吸取注射，每千克體質(zhì)量注射0.1 mL)，再緩慢注入生理鹽水(每千克體質(zhì)量注射生理鹽水0.8 mL).

1.3.2 樣品收集

(1)肺組織 大鼠頸椎脫臼處死后，迅速剝?nèi)〈笫蠓谓M織，生理鹽水清洗肺表面，部分組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定，部分組織經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，用于后續(xù)RT-PCR、Western blot、免疫組化和HE實(shí)驗(yàn).

(2)肺泡灌洗液(alveolar lavage fluid, BALF) 將大鼠頸部毛發(fā)剃除后充分暴露頸部，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒，縱向切開皮膚，暴露氣管，結(jié)扎右支氣管，于氣管下1/3處開倒“T”字口，插入無菌塑料管約1～1.5 cm，使插管插至左主支氣管內(nèi)，固定插管.用37 ℃生理鹽水灌洗(每千克大鼠體質(zhì)量使用生理鹽水15 mL)，再將灌洗液緩慢抽出，重復(fù)該步驟5次.在灌洗時，同時給予大鼠0.3 mL空氣，確保生理鹽水到達(dá)大鼠肺臟.每次灌洗回收液的回收率>80%，此即為BALF.將BALF轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，于4 ℃、1 500 r/min條件下離心15 min，取上清液，-80 ℃保存.

1.3.3 ELISA檢測BALF中TNF-α、IL-6和IL-10質(zhì)量濃度

將樣品加入96孔板中，設(shè)置空白對照孔和待測樣品孔，依次加入樣品稀釋液40 μL和待測樣品10 μL；空白對照孔中不加樣品，每孔中分別加入酶標(biāo)試劑100 μL，其余步驟同待測樣品孔；酶標(biāo)板經(jīng)封板膜封閉后，于37 ℃下孵育60 min；酶標(biāo)板孵育完成后，依次加入顯色劑A和顯色劑B顯色反應(yīng)，終止反應(yīng)后，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測量各孔的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-10質(zhì)量濃度.

1.3.4 HE染色觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化

取出經(jīng)多聚甲醛固定的標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，二甲苯中浸泡2次，每次10 min，體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇中浸泡2次，每次2 min, 體積分?jǐn)?shù)分別為95%、90%和85%的乙醇中脫水1 min，蒸餾水浸泡1 min，進(jìn)行脫蠟水化；蘇木素染色5 min，流水沖洗2 min，體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸乙醇浸泡2 s，水洗2 min，返藍(lán)2 min(80 ℃左右熱水)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的伊紅染色5 min，經(jīng)水洗2 min，體積分?jǐn)?shù)分別為75%、85%和90%的乙醇各浸泡1 min，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡2 min，100%乙醇中浸泡2次，每次3 min.二甲苯中浸泡3次，每次10 min.中性樹膠封片.顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化.

1.3.5 免疫組化檢測ET-1、VCAM-1和VEGF因子表達(dá)

采用免疫組化方法檢測大鼠肺組織中血清內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的陽性表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說明書.

1.3.6 Western blot檢測大鼠肺組織PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表達(dá)

取出液氮保存的肺組織，研碎至勻漿后，4 ℃放置30 min，13 000 r/min離心10 min，取部分上清，BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度，另一部分上清加入4倍上樣緩沖液，煮沸變性后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠電泳分離，PVDF膜和濾紙浸泡轉(zhuǎn)膜緩沖液中，接通電源，在400 mA電流下轉(zhuǎn)膜1.5 h；轉(zhuǎn)膜結(jié)束，取出PVDF膜置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉中，室溫封閉1.5 h，用TBST稀釋一抗(V一抗:VTBST=1∶1 000)，將目的條帶浸于其中，于4 ℃過夜孵育.一抗孵育完成，用TBST洗滌條帶3次，每次10 min.將目的條帶浸入二抗稀釋液(V二抗∶VTBST=1∶6 000)中，于37 ℃孵育1.5 h后，再次用TBST洗滌條帶3次，每次10 min.目的條帶放置自動曝光裝置的暗盒中，條帶滴加ECL發(fā)光液(V試劑A∶V試劑B=1∶1)反應(yīng)5 min，使其顯色發(fā)光.自動曝光系統(tǒng)曝光并拍照，條帶用Image Pro進(jìn)行分析.

1.3.7 RT-PCR檢測大鼠肺組織中PI3K、AKT的mRNA表達(dá)

按照試劑盒說明書提取各組織中的總RNA，檢驗(yàn)純度和完整性后，檢測肺組織中PI3K和AKT的mRNA表達(dá)變化，關(guān)鍵步驟：肺組織標(biāo)本加入1.5 mL Trizol于研磨至勻漿，室溫靜置5 min，13 000 r/min 離心5 min，吸取上清，加入氯仿(V上清∶V氯仿=5∶1)，靜置離心，吸取上清加入等體積異丙醇(V上清∶V異丙醇=1∶1)，靜置離心，棄去上清，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇清洗沉淀，離心棄上清，保留沉淀干燥，用DEPC水溶解.按照Takara反應(yīng)試劑盒說明書依次進(jìn)行去除基因組DNA反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和RT-PCR擴(kuò)增，預(yù)變性：95 ℃、10 min、1循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增：95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s、40循環(huán)數(shù).擴(kuò)增結(jié)束后，計(jì)算目的基因相對表達(dá)量F=2-ΔΔCt.其中ΔΔCt=(待測樣品目的基因的Ct平均值-待測樣本管家基因的Ct平均值)-(對照樣品目的基因的Ct平均值-對照樣本管家基因的Ct平均值).

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 ARDS大鼠模型構(gòu)建結(jié)果

注射油酸約3 min后，ARDS組和阿米洛利組大鼠開始出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征樣癥狀，包括呼吸頻率增快、呼吸費(fèi)力、活動減少、毛發(fā)直立、嘴唇、顏面紫紺等，提示ARDS大鼠模型構(gòu)建成功.空白對照組和DMSO組大鼠無上述變化，精神狀態(tài)、呼吸、活動情況等良好.

2.2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-10的變化

注射油酸4 h、8 h和12 h后，與空白對照組比較，DMSO組TNF-α、IL-6、IL-10的變化不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與DMSO組比較，ARDS組大鼠BALF中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均顯著升高(P<0.05)，IL-10質(zhì)量濃度均顯著降低(P<0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠BALF中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均顯著降低(P<0.05)，IL-10質(zhì)量濃度均顯著升高(P<0.05)(圖1).由此提示，阿米洛利可降低ARDS大鼠BALF中促炎因子TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度，增加抗炎因子IL-10質(zhì)量濃度，進(jìn)而影響ARDS大鼠的炎癥反應(yīng).

1) P<0.05

2.3 大鼠肺組織病理學(xué)變化

對各組大鼠肺組織切片進(jìn)行HE染色，觀察發(fā)現(xiàn)空白對照組和DMSO組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整、清楚，未發(fā)生明顯的病理學(xué)變化和炎性細(xì)胞浸潤，且兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.油酸注射4 h后，與空白對照組比較，ARDS組和阿米洛利組大鼠肺組織切片中可見肺水腫、出血，肺泡壁增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)被破壞.油酸注射8 h和12 h后，與空白對照組比較，ARDS組大鼠肺組織切片中肺水腫、肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，部分肺泡壞死，炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步提示ARDS大鼠模型構(gòu)建成功.與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠肺部肺水腫、肺泡結(jié)構(gòu)破壞及肺泡壁增厚現(xiàn)象明顯被改善，炎性細(xì)胞浸潤減少(圖2).由此提示，阿米洛利可明顯修復(fù)ARDS大鼠的肺部組織結(jié)構(gòu).

2.4 大鼠肺組織中ET-1蛋白表達(dá)變化

注射油酸4 h后，空白對照組和DMSO組ET-1呈弱陽性表達(dá)，視野中可見少量棕黃色，且兩組間ET-1陽性表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與空白對照組比較，ARDS組ET-1陽性表達(dá)明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠肺組織中ET-1陽性表達(dá)明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).注射油酸8 h、12 h后，空白對照組和DMSO組大鼠肺組織切片中ET-1表達(dá)變化情況和4 h一致，與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠肺組織中ET-1陽性表達(dá)均明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且阿米洛利干預(yù)后，ET-1的表達(dá)量隨著時間越來越低，說明阿米洛利可下調(diào)ET-1水平，對ARDS大鼠肺部起到治療作用(圖3).

2.5 大鼠肺組織中VCAM-1蛋白表達(dá)變化

注射油酸4 h后，空白組和DMSO組VCAM-1呈弱陽性表達(dá)，可見少量棕黃色視野，且兩組間VCAM-1表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).與空白對照組比較，ARDS組VCAM-1陽性表達(dá)均明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠肺組織中VCAM-1陽性表達(dá)均明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).注射油酸8 h、12 h后，阿米洛利組大鼠肺組織中VCAM-1陽性表達(dá)減少更多，說明阿米洛利可下調(diào)VCAM-1水平，從而對ARDS大鼠肺部起到治療作用(圖4).

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化(HE,200×)

1) P<0.05

1)P<0.05

2.6 大鼠肺組織中VEGF蛋白表達(dá)變化

注射油酸4 h后，VEGF在大鼠肺組織中的陽性表達(dá)水平，其中空白組和DMSO組VEGF可見大量棕黃色視野，且兩組間VEGF表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).與空白對照組比較，ARDS組VEGF陽性表明明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠肺組織中VEGF陽性表達(dá)明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).注射油酸8 h、12 h后，阿米洛利組大鼠肺組織中VEGF陽性表達(dá)增加多，說明阿米洛利可上調(diào)VEGF水平，從而對ARDS大鼠肺部起到保護(hù)作用(圖5).

1) P<0.05

2.7 大鼠肺組織PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵因子PI3K、p-P13、AKT和p-AKT 蛋白表達(dá)結(jié)果

注射油酸4 h后，與空白對照組比較，DMSO組PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，ARDS組與DMSO組相比總PI3K和AKT蛋白表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組總PI3K和AKT、p-PI3K的蛋白表達(dá)變化不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，p-AKT蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05).(圖6)

注射油酸8 h后，與空白對照組比較，DMSO組AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)水平不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，ARDS組與DMSO組相比，總PI3K和AKT蛋白表達(dá)差異不顯著(P>0.05)；p-AKT和p-PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組總PI3K和AKT蛋白表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05).(圖7)

注射油酸12 h，與空白對照組比較，DMSO組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，ARDS組總PI3K和AKT蛋白表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)； p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組總PI3K和AKT蛋白表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05).(圖8)

由此提示，阿米洛利可降低p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平，從而抑制PI3K/AKT信號通路，保護(hù)ARDS大鼠肺部組織.

2.8 各組大鼠肺組織中AKT和PI3K mRNA表達(dá)變化

注射油酸4 h后，與空白對照組比較，DMSO組AKT和PI3KmRNA表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠肺組織中AKT和PI3KmRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；注射油酸8 h和12 h后，與空白對照組比較，DMSO組AKT和PI3KmRNA表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與ARDS組比較，阿米洛利組大鼠肺組織中AKT和PI3KmRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在注射油酸8h時，ARDS組AKT和PI3KmRNA表達(dá)水平最高，隨著油酸注射時間的延長，AKT和PI3KmRNA表達(dá)水平明顯下降，進(jìn)一步說明阿米洛利可抑制PI3K/AKT信號通路.(圖9)

1) P<0.05

1) P<0.05

1) P<0.05

1) P<0.05

3 討論

ARDS以肺水腫、難治性低氧血癥、多種臟器功能衰竭為特征，是多種疾病炎癥反應(yīng)過度的結(jié)果，會引起肺泡-毛細(xì)血管屏障喪失、肺泡內(nèi)充滿液體、肥大上皮損傷、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞流入、凝血激活和纖溶抑制導(dǎo)致纖維蛋白沉積等多種病理學(xué)變化[9-10].本研究采用的造模方法是通用的油酸誘導(dǎo)型大鼠ARDS模型，在病因上可模擬ARDS患者的病理生理學(xué)表現(xiàn)，且具有操作簡便、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用[11-12]，研究結(jié)果顯示，大鼠注射油酸后，3 min左右開始出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征樣癥狀，同時 ARDS大鼠肺組織有肺泡水腫、肺泡出血、肺泡壁破壞等典型病理改變的情況，說明ARDS大鼠模型構(gòu)建成功，可以用作下一步實(shí)驗(yàn).為了確定阿米洛利溶解劑DMSO對大鼠有無影響，本研究設(shè)計(jì)大鼠僅注射DMSO的DMSO組，結(jié)果顯示，DMSO組和空白對照組大鼠之間各種變化并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，討論中將不再對DMSO組進(jìn)行單獨(dú)分析說明.

TNF-α作為重要的促炎因子[13]，不僅能損傷血管內(nèi)皮，摧毀其屏障功能，增加毛細(xì)血管通透性，促使大量液體滲出，形成肺水腫，導(dǎo)致ARDS的發(fā)生，還可抑制抗氧化劑的產(chǎn)生，使組織中氧自由基增多，加重組織損傷和疾病惡化[14-15].研究表明，TNF-α、IL-6、IL-10等參與ARDS引起的肺損傷和修復(fù).正常情況下，機(jī)體內(nèi)TNF-α表達(dá)量低，而當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時，TNF-α被大量釋放到局部組織，介導(dǎo)疾病的發(fā)展.IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，通過抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)恢復(fù)機(jī)體炎癥和抗炎反應(yīng)之間的平衡[16]，促炎因子與抗炎因子相互作用的程度決定了ARDS炎癥反應(yīng)的發(fā)展方向，本研究發(fā)現(xiàn)在ARDS大鼠的BALF中，抗炎因子TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度均顯著增加，促炎因子IL-10質(zhì)量濃度減少；而當(dāng)給予大鼠阿米洛利干預(yù)后，TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度均顯著減少，IL-10質(zhì)量濃度增加，提示阿米洛利可通過抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的質(zhì)量濃度和促進(jìn)抗炎因子IL-10的質(zhì)量濃度，從而減輕ARDS大鼠的炎癥反應(yīng).

ET-1主要產(chǎn)生于肺中，在呼吸系統(tǒng)中發(fā)揮血管調(diào)節(jié)、支氣管收縮、細(xì)胞增殖和炎癥等多種生物活性[17].臨床試驗(yàn)中，ARDS患者ET-1水平升高，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[18]，是ARDS發(fā)病機(jī)制中的炎性介質(zhì)之一，ET-1可誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α、MCP-1和VCAM-1等多種促炎因子[19].VEGF是ARDS導(dǎo)致肺損傷的主要調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)ARDS的發(fā)生和發(fā)展[20].VCAM-1正常條件下低表達(dá)或不表達(dá)，當(dāng)ARDS發(fā)生時，其在肺泡上皮、血管上皮和支氣管黏膜上皮細(xì)胞中高表達(dá)，也是用于評估ARDS嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物之一.本研究發(fā)現(xiàn)在ARDS大鼠肺組織中ET-1、VCAM-1的表達(dá)水平明顯高于空白對照組，而VEGF的表達(dá)水平低于空白對照組，利用阿米洛利干預(yù)治療后，ARDS大鼠肺組織中ET-1、VCAM-1表達(dá)水平則顯著下調(diào)，而VEGF的表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)，說明阿米洛利對ARDS大鼠肺損傷具有修復(fù)和保護(hù)的作用.

PI3K/AKT通路參與多種生物學(xué)過程.研究表明，脂多糖通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能[21].血紅素氧合酶-1抑制脂多糖誘導(dǎo)的ARDS大鼠模型的氧化應(yīng)激和肺損傷可能是通過PI3K/AKT信號通路實(shí)現(xiàn)的[22].在ARDS小鼠肺組織中用PI3K抑制劑渥曼青霉素上調(diào)p-AKT蛋白表達(dá)水平，加重了ARDS和肺損傷[23].由此可見，PI3K/AKT信號通路在ARDS中發(fā)揮重要作用.本研究發(fā)現(xiàn)在ARDS大鼠肺組織中PI3K/AKT信號通路被激活，使大鼠BALF中促炎因子大量釋放，抗炎因子被抑制；而阿米洛利干預(yù)后大鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT表達(dá)減少，進(jìn)而使TNF-α、IL-6、VCAM-1和ET-1水平下調(diào)，IL-10和VEGF水平上調(diào)，改善ARDS大鼠肺水腫及炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其對ARDS大鼠肺損傷的保護(hù)作用.但是在ARDS的發(fā)生和發(fā)展過程中，多個信號通路共同參與調(diào)節(jié)其發(fā)展.本研究僅對 PI3K/AKT 信號通路進(jìn)行了研究，而阿米洛利改善 ARDS 大鼠肺損傷過程中是否存在其他信號通路，這些信號通路之間的平衡是如何調(diào)控的，還有待進(jìn)一步的研究.

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)阿米洛利在ARDS致肺損傷中具有治療作用，并證實(shí)PI3K/AKT信號通路是該保護(hù)作用的機(jī)制之一，為ARDS的臨床治療提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持和新的思路.