張繼云, 趙旌, 努爾夏提·塔布什, 羅莉

(新疆醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科， 烏魯木齊 830054; 新疆醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科， 烏魯木齊 830063)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因尚不明確，可以侵犯全身多系統(tǒng)的慢性彌漫性結(jié)締組織病，體內(nèi)出現(xiàn)多種自身抗體，使機體免疫系統(tǒng)攻擊自身組織，引起全身多臟器和組織損傷.SLE免疫調(diào)節(jié)異常的表現(xiàn)極其復(fù)雜，包括自身反應(yīng)性淋巴細胞耐受異常、凋亡異常、細胞因子分泌及其受體表達異常以及對激活信號內(nèi)源性反應(yīng)增高等[1-2].IκB激酶復(fù)合物 (IκB- kinase complex，IKK)是核因子KappaB (nuclear factor-κB, NF-κB)活化中不可或缺的關(guān)鍵酶，是一個蛋白激酶復(fù)合體，主要由IKKα、IKKβ、IKKγ組成，其中IKKβ是具有關(guān)鍵作用的激酶.細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1等通過刺激IKK引起IκB磷酸化、泛素化和降解，使活化核因子-κB(NF-κB)轉(zhuǎn)位入核與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，從而調(diào)控大量炎癥因子，誘導(dǎo)T細胞的增殖、分化，參與了SLE的發(fā)病[3-4].

白介素-38(interleukin-38，IL-38)是白介素-1 家族成員中的一員，目前研究認(rèn)為是人體中重要的抗炎細胞因子，抑制巨噬細胞分泌如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性細胞因子，同時介導(dǎo)輔助性T細胞17(thelper 17 cell,Th17)細胞所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在免疫和感染相關(guān)疾病的發(fā)病機制中具有重要的作用[5-8].因此，本研究旨在分析IL-38在活動期SLE患者體內(nèi)的表達水平，并探索在SLE患者體內(nèi)IL-38與IKKβ表達水平之間的關(guān)系，以揭示SLE內(nèi)在的免疫學(xué)機制，為臨床發(fā)現(xiàn)新的診治方案和靶向藥物提供方向.

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院30例SLE住院患者，年齡24～59歲，平均(35±10)歲，其中女性21例，男性9例，診斷均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)院修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)，SLEDAI評分大于8分，病情均處于活動期.30例體檢中心的健康人群作為正常對照，年齡27～54歲，平均(33±7)歲，其中女性20例，男性10例，均無風(fēng)濕病史和風(fēng)濕病家族史.各組間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義.本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)(20190512-11)，所有患者知情同意后，獲取血液標(biāo)本.

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑

TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(江萊生物)；人白細胞介素38酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(江萊生物)；Trizol(invitrogen)，DEPC處理水(無錫菩禾)；氯仿/異丙醇/無水乙醇(上海國藥)；SYBR Green PCR試劑盒(Thermo F-415XL)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo #K1622)；全血總RNA快速抽提試劑盒(生工 B518623).

1.2.2 儀器

超凈工作臺(蘇州安泰科技有限公司)；低溫冷凍離心機(Sigma 3K15)，Real-time檢測儀(ABI-7500)；酶標(biāo)檢測儀 (Thermo MK3 型).

1.3 實驗方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測IL-38、TNF-α蛋白表達水平

收集血清分離管的全血標(biāo)本于3 000 r/min離心5 min，取上清進行ELISA檢測.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，分別加入待測樣本及抗體，溫育后靜置，重復(fù)洗板5次，37 ℃避光孵育后加終止液，測定各孔的吸光度值.

表1 qRT-PCR檢測引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測IL-38 mRNA、IKKβ mRNA

按Trizol法提取血液中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA.在Real-time檢測儀上以cDNA為模版利用DNA聚合酶TaKaRa EX TapTM HS進行實時定量PCR擴增反應(yīng)，實時熒光定量PCR儀自動分析結(jié)果.引物序列見表1.采用2-ΔΔCt法分析目的基因在對照組和各實驗組之間的表達差異，計算標(biāo)準(zhǔn)化后2-ΔΔCt值表示mRNA 的相對表達量，即為各組中基因的相對表達量.

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 活動期SLE組和正常對照組IL-38表達水平的比較

qRT-PCR、ELISA法檢測活動期SLE組和正常對照組IL-38表達水平，發(fā)現(xiàn)活動期SLE患者IL-38 mRNA表達水平(0.36±0.09)顯著低于正常對照組(1.00±0.17)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；活動期SLE患者IL-38蛋白表達水平(5.86±2.76)pg/mL顯著低于正常對照組(18.48±1.35)pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1).

2.2 活動期SLE組和正常對照組TNF-α蛋白表達水平的比較

ELISA法檢測結(jié)果顯示活動期SLE患者TNF-α蛋白表達水平(10.78±1.25)pg/mL明顯高于正常對照組(4.34±0.69)pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且活動期SLE患者IL-38與TNF-α蛋白表達水平呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2).

2.3 活動期SLE組和正常對照組IKKβ mRNA表達水平的比較

qRT-PCR結(jié)果顯示活動期SLE患者IKKβ mRNA表達水平(6.01±1.51)高于正常對照組(1.16±0.14)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且活動期SLE患者IL-38與IKKβ mRNA表達水平呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3).

與對照組比較：1)P<0.01；2)P<0.05Compared with control group: 1)P<0.01；2)P<0.05

1)與對照組比較，P<0.051)Compared with control group，P<0.05

1)與對照組比較，P<0.011)Compared with control group，P<0.01

3 討論

白介素-1家族細胞因子普遍存在機體炎性細胞內(nèi)，在機體的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[9].IL-38曾被命名為IL-1F10、IL-1HY2[10]，是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，目前的研究已掌握其基本結(jié)構(gòu)特征，IL-38與IL-1家族其他成員有相似的特點，在免疫組織中呈高表達[11-12]，然而它的生物學(xué)功能尚不為我們所知.研究發(fā)現(xiàn)IL-38能夠與IL-36受體結(jié)合，因此IL-38有非典型IL-36受體阻滯劑功能，在免疫炎癥過程中發(fā)揮類似IL-36受體拮抗劑的作用[13-14].最近的研究表明,在SLE、炎癥性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和炎性腸病等疾病中，IL-38通過抑制炎癥信號通路發(fā)揮免疫抑制作用，從而認(rèn)為參與了炎癥性疾病的發(fā)病[15-18].在前期研究中，發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中IL-38表達減少，使得TH17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子高表達，造成TH17細胞數(shù)量及其細胞因子IL17表達增加，導(dǎo)致機體關(guān)節(jié)乃至全身性的炎癥反應(yīng)，引發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[19].

SLE是機體在遺傳及環(huán)境雙重因素的共同作用下，體內(nèi)免疫系統(tǒng)紊亂從而產(chǎn)生過多的自身抗體，造成全身多系統(tǒng)病變，主要包括炎癥信號通路及T、B淋巴細胞的活化.目前發(fā)現(xiàn)在狼瘡鼠體內(nèi)IL-38能夠抑制TNF-α、IL-6和IFN-γ等的產(chǎn)生，并且能改善皮膚、腎臟的病變[20]. 本研究檢測活動期SLE患者體內(nèi)的IL-38基因及蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)其明顯低于健康對照組，推測在活動期SLE患者體內(nèi)由于IL-38表達減少，使其抑制免疫炎癥作用下降，促進了SLE的發(fā)病，說明IL-38具有免疫抑制作用，這與目前國內(nèi)外的研究結(jié)論一致.

NF-κB是調(diào)控免疫炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子.已有研究證實SLE患者NF-KB活性顯著高于正常對照，其活化程度與血清中IgG及抗dsDNA水平呈正相關(guān)，因此，NF-κB在SLE的發(fā)病機制中起重要作用，其中TNF-α是NF-KB通路活化的刺激因子，IKKβ是活化過程中的關(guān)鍵激酶.為進一步深入探究在活動期SLE患者體內(nèi)IL-38是如何發(fā)揮其免疫抑制作用，本研究檢測了活動期SLE患者體內(nèi)TNF-α和IKKβ的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活動期SLE患者體內(nèi)TNF-α和IKKβ表達水平均較正常對照組顯著升高，并且通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IL-38與TNF-α蛋白表達水平呈負相關(guān)，說明在活動期SLE患者體內(nèi)IL-38蛋白表達水平下降，造成TNF-α的過度分泌從而通過激活I(lǐng)KKβ活化NF-κB通路，造成機體的免疫異常.同時在研究中發(fā)現(xiàn)在活動期SLE患者體內(nèi)IL-38與IKKβ mRNA表達水平呈負相關(guān)，說明IL-38與 IKKβ的表達活化有關(guān).因此，通過上述結(jié)果，推測IL-38一方面可以通過TNF-α激活I(lǐng)KKβ激酶，另一方面可以直接作用于IKKβ激酶，從而調(diào)控IKKβ/NF-κB通路的活化.

目前IL-38在SLE中的作用機制尚未清楚，本研究顯示，在活動期SLE患者體內(nèi)IL-38表達水平降低，促進體內(nèi)TNF-α的大量產(chǎn)生從而激活I(lǐng)KKβ，同時IL-38表達水平下降造成IKKβ的活化，活化的IKKβ引起IκB磷酸化、泛素化和降解，使NF-κB轉(zhuǎn)位入核與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，大量T、B淋巴細胞的增殖和炎癥因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致機體SLE的發(fā)病.通過前期以及本研究的結(jié)果，推測IL-38可能是引發(fā)自身免疫性疾病的重要原因之一，其具體機制還需要更多的基礎(chǔ)與臨床研究來探討.