李錦忠， 楊阮阮， 李敏然， 龔曉兵

(暨南大學 附屬第一醫(yī)院 感染科， 廣東廣州 510632)

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是肝臟功能障礙引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)功能失調(diào)綜合征，其中一個主要的病因是肝代謝功能下降導致的毒物聚集，當腸源性毒性產(chǎn)物透過血腦屏障后，在腦組織中積聚，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，最終導致患者出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，如早期的興奮性增高，以及晚期的意識障礙、行為失常和昏迷等[1].如何早期識別HE的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，預防不可逆的腦損傷是HE治療的關鍵環(huán)節(jié)之一.HE發(fā)病機制復雜，主要學說有氨中毒、代謝紊亂、氨基酸失衡及氧化應激等[2].星形膠質(zhì)細胞是血腦屏障的關鍵成分，通過維持腦中的溶質(zhì)水穩(wěn)態(tài)來保護神經(jīng)元免受興奮性毒性.因此，星形膠質(zhì)細胞紊亂成為腦水腫和神經(jīng)元改變的關鍵特征[3].

谷氨酸(glutamate,Glu)是CNS中含量最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，而HE的發(fā)生與氨過多、神經(jīng)遞質(zhì)功能失衡有關[4].HE患者及其動物模型中Glu神經(jīng)遞質(zhì)功能不良，其受體結(jié)合位點減少甚至缺失[5].所以HE患者的血氨影響Glu受體功能與代謝，進而導致HE患者的腦細胞功能紊亂，但具體機制不明.

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA.研究表明LncRNA在劑量補償效應、表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，成為遺傳學研究熱點[6-7].LncRNA在缺血缺氧性腦病、腦膠質(zhì)瘤、精神疾病和腦發(fā)育等方面的研究不斷有新的發(fā)展和突破，但有關LncRNA對肝性腦病的作用和調(diào)控機制知之甚少.本研究小組首次發(fā)現(xiàn)一個在HE中特異性高表達的LncRNA—LINC00092，對其進行初步鑒定：LINC00092全長3064bp，利用編碼潛力評估工具 (coding potential assessment tool，CPAT)對其編碼能力進行預測，結(jié)果提示無編碼能力.Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞旁分泌誘導LINC00092過度表達，LINC00092與PFKFB2相互作用，在卵巢癌中誘導糖酵解表型并促進卵巢癌轉(zhuǎn)移.Huang等[9]也證實LINC00092在結(jié)直腸癌中的診斷和預后能力.因此，探索LINC00092在HE的發(fā)生發(fā)展中的作用，對于尋找合理有效的HE預防和治療措施具有十分重要的意義.

1 材料和方法

1.1 篩查HE中起關鍵作用的LncRNA

本研究小組從基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expressionomnibus,GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載了芯片GSE57193的數(shù)據(jù)，包括4個肝硬化伴HE和4個健康對照(healthy control,HC)的腦組織樣本的基因表達譜，根據(jù)P<0.05和|log2FC|>0.5的標準，利用R(3.6.1)語言(https://www.r-project.org/)的limma包篩選出HE和HC中差異的LncRNA和mRNA(圖1).

A.log2FC代表取對數(shù)后差異表達基因調(diào)整倍數(shù)(0.5倍)，-lgPadj代表校正后的P值(0.05)，圖中的紅點表示上調(diào)的差異表達基因，綠點代表下調(diào)的差異表達基因，黑點代表差異改變不明顯的基因.B.頂端粉紅色代表HE，藍色代表HC；紅色表示該基因在樣品中高表達，而綠色在樣品中低表達.

1.2 KEGG信號通路分析

根據(jù)差異表達基因的符號和序列號(ID)，利用clusterProfiler包進行差異表達基因的京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析，以P<0.05為標準輸出結(jié)果.

1.3 ceRNA網(wǎng)絡的構(gòu)建

競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)網(wǎng)絡的構(gòu)建方法如下：從miRcode數(shù)據(jù)庫下載差異表達LncRNA靶向的miRNA數(shù)據(jù)，使用Targetscan、miRdb和miRTarBase預測miRNA靶向的mRNA，然后與差異表達mRNA取交集得到目標mRNA.最終保留與差異表達的lncRNA，miRNA和mRNA的交叉點.Cytoscape(3.72)用于構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網(wǎng)絡.

1.4 LINC00092在肝性腦病中機制假說的預測

通過RNA結(jié)合蛋白特異性數(shù)據(jù)庫 (the database of RNA-binding protein specificities,RBPDB) (http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/)預測LINC00092的RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)，根據(jù)表達的相關性和RNA結(jié)合蛋白，提出LINC00092在肝性腦病中的機制假說.

2 結(jié)果

2.1 差異表達的LncRNA和mRNA及KEGG富集分析

根據(jù)P<0.05和|log2FC|>0.5的標準，從正常腦組織中篩選出HE中9個特異的LncRNA和728個特異的mRNA，其中LINC00092相對HC在HE中特異性高表達(圖1).差異表達基因的KEGG富集分析顯示，它們主要集中在脂肪酸降解、過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)信號通路、礦物質(zhì)的吸收、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、β-丙氨酸新陳代謝、脂肪酸代謝通路上(表1).

表1 差異表達基因的KEGG通路富集分析Table 1 Enrichment analysis of differentially expressed genes by KEGG pathway

2.2 LINC00092在肝性腦病中的作用機制

通過ceRNA網(wǎng)絡(圖2)可以看到LncRNA可通過競爭結(jié)合共同的micRNA應答元件(microRNA response elements，MREs)實現(xiàn)調(diào)節(jié)mRNA的表達.根據(jù)ceRNA網(wǎng)絡和RBP(表2)，發(fā)現(xiàn)LINC0009在HE中存在3個調(diào)控通路：(1)LINC00092/hsa-miR206/GJA1軸介導Glu的神經(jīng)興奮毒性損傷；(2)LINC00092/hsa-miR184/LRRC8A軸介導星形膠質(zhì)細胞的溶脹激活和ATP誘導的興奮性氨基酸釋放；(3)LINC00092-A2BP1軸介導的Glu再攝取(圖3).

表2 LINC00092與多個RNA結(jié)合蛋白存在結(jié)合靶點

紅色代表的是LncRNA，藍色代表的是miRNA，綠色代表的是mRNA，任何2個基因間的連線代表兩者間的相互作用.

圖3 LINC00092介導谷氨酸的興奮性毒性在肝性腦病中的機制假說

3 討論

目前LncRNA在肝性腦病的研究仍是空白，本研究小組首次發(fā)現(xiàn)一個在HE中特異性高表達的LncRNA—LINC00092，它的編碼基因位于9號染色體reverse鏈96019724至96027993號堿基處，共6個轉(zhuǎn)錄本，本研究的研究對象為LINC00092-202，全長3064bp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC0009在HE中存在3個調(diào)控路徑，各個路徑間存在相互作用.

縫隙連接(gapjunction，GJ)是間隙連接通道的簇，能介導電信號和化學信號有效且快速的雙向細胞間傳輸，半通道(hemichannel,HC)是由GJA1[也稱為連接蛋白(connexin,Cx)43]，組成的六聚體結(jié)構(gòu)，介導細胞內(nèi)外的信息交流[10-11]. LINC00092/hsa-miR206/GJA1軸介導Glu的神經(jīng)興奮性毒性損傷.GJA1是連接蛋白家族中在脊椎動物中高度保守的成員，以六聚體復合物的形式存在于質(zhì)膜上，并起連接蛋白半通道的作用，從而發(fā)揮調(diào)控小分子和離子流通的功能[12]. GJA1是星形膠質(zhì)細胞中含量最多的連接蛋白，而星形膠質(zhì)細胞在正常的神經(jīng)活動中起主要作用，它們?yōu)樯窠?jīng)元提供代謝和結(jié)構(gòu)支持，控制細胞外谷氨酸、鉀、氫離子濃度，調(diào)節(jié)細胞外液的容量[13-15].這些功能取決于相鄰兩個星形膠質(zhì)細胞通過GJ形成的功能合胞體，對谷氨酸、鉀等起到“空間稀釋”作用[16].當受到外來侵犯時，受損細胞通過GJ將Glu等有害物質(zhì)釋放到相鄰細胞，起到了自我保護作用.同時GJA1還可作為HC參與旁分泌交流[17]，但這種活動通常與病理狀況有關[18].HC通道的開放導致大量Glu、ATP等毒性物質(zhì)的釋放，Glu通過興奮性毒性殺死神經(jīng)元，一方面是Glu下游的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體的持續(xù)活化以及隨后大量Ca2+涌入有活力的神經(jīng)元引起的興奮性毒性損傷的主要信號轉(zhuǎn)導劑，它可能通過各種機制進入細胞，但最重要的機制是通過與NMDA受體偶聯(lián)的離子通道進入細胞[19].其次是由于HC通道是通過Ca2+內(nèi)流介導的Glu釋放，二者都使細胞內(nèi)線粒體Ca2+超載，細胞膜去極化而導致神經(jīng)元功能障礙和細胞死亡[20]，同時活性氧的產(chǎn)生可以抑制星形膠質(zhì)細胞谷氨酰合酶的活性，干擾谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)[21].本研究發(fā)現(xiàn)LINC00092、hsa-miR-206和GJA1之間存在調(diào)控關系，其中LINC00092和GJA1呈共表達關系，提示LINC00092可能通過吸附hsa-miR-206靶向調(diào)控下游GJA1，抑或通過調(diào)控hsa-miR-206的前體轉(zhuǎn)錄本的水平.但病理狀態(tài)下表達上調(diào)的GJA1是通過何種機制關閉GJ通路和開放HC通路仍不清楚.介導GJA1在這兩種通路間的轉(zhuǎn)變可成為一種新的治療方向.

LINC00092/hsa-miR184/LRRC8A軸介導星形膠質(zhì)細胞的溶脹激活和ATP誘導的興奮性氨基酸釋放.LRRC8A(leucine-rich repeat-containing protein 8A)屬于Lrrc8基因家族，其他成員包括Lrrc8b，Lrrc8c，Lrrc8d，和Lrrc8e[22-23].體積調(diào)節(jié)陰離子通道(the volume-regulated anion channel,VRAC)通過細胞膨脹激活，并在細胞體積調(diào)節(jié)中起關鍵作用.VRAC在脊椎動物細胞中普遍表達，并且還與許多其他生理和細胞過程有關，包括液體分泌、Glu釋放、膜電位調(diào)節(jié)、細胞增殖、遷移和凋亡[24].LRRC8A及4個其他同源物形成了異源VRAC通道,但連接LRRC8A跨膜結(jié)構(gòu)域2和3的細胞內(nèi)環(huán)(IL)和連接LRRC8C，LRRC8D或LRRC8E跨膜結(jié)構(gòu)域1和2的第1個細胞外環(huán)(EL1)都是VRAC激活所必需的[25].細胞膨脹后，VRAC活化導致釋放Cl-和有機滲透物(例如?；撬?，谷氨酸和天冬氨酸)[26-28]，這與細胞內(nèi)K+的擠出平行[29].與此同時，離子流出會產(chǎn)生驅(qū)動水流出所需的滲透梯度，從而使生理細胞體積得以恢復[30].肝臟功能障礙引起毒物聚集，當腸源性毒性產(chǎn)物透過血腦屏障后，在腦組織中積聚引起腦水腫.結(jié)合前期研究推測：腦水腫刺激腦組織上調(diào)LINC00092的表達，LINC00092可能通過吸附hsa-miR-184靶向調(diào)控下游LRRC8A，抑或通過調(diào)控hsa-miR-184的前體轉(zhuǎn)錄本的水平.LRRC8A通過VRAC反饋性調(diào)控細胞體積的同時，也過量釋放了Glu，后者可通過興奮性毒性殺死神經(jīng)元.

LINC00092-A2BP1軸介導的Glu再攝取.A2BP1(ataxin 2-binding protein 1)，也稱為 RBFOX1，是一種神經(jīng)元特異性剪接因子，對替代剪接具有正調(diào)節(jié)作用和負調(diào)節(jié)作用[31-32].該基因突變已被證實與癲癇、智力發(fā)育遲滯[33-34]以及自閉癥[35]等一系列神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病相關.Rbfox1通過與可選擇性外顯子兩翼的內(nèi)含子中的(U)GCAUG 序列結(jié)合，以達到調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)選擇性剪接作用的目的[36].RBFOX1的靶基因中包括了與癲癇和共濟失調(diào)相關的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白 EAAT1[37].Gehman等[38]發(fā)現(xiàn)Rbfox1的基因缺失導致對自發(fā)和海藻酸誘發(fā)的癲癇發(fā)作的敏感性增加，電生理記錄顯示，基因敲除小鼠的齒狀回中神經(jīng)元興奮性相應增加.同時全轉(zhuǎn)錄組分析確定了Rbfox1(-/-)腦中的多個剪接變化，其中包括GABA-A受體γ2、NMDA受體1.這些剪接變化改變了介導突觸傳遞和膜興奮的蛋白質(zhì).因此，A2BP1指導了預防神經(jīng)元過度興奮和癲癇發(fā)作所需的遺傳程序，但具體機制不明.因此提出假設：HE狀態(tài)下過表達的LINC00092結(jié)合A2BP1后，可將A2BP1定位至特定的DNA上，通過可變剪切下調(diào)EAAT1的轉(zhuǎn)錄，影響了EAAT1對突觸間隙Glu的再攝?。煌瑫r與LINC00092結(jié)合的A2BP1對NMDA受體1可變剪切的調(diào)控能力減弱，使突觸后膜上的NMDA受體1表達增多.以上兩種情況加劇了LINC00092介導的Glu的細胞外蓄積及興奮性毒性傷害.

綜上，LINC00092在HE中特異性高表達，一方面通過半通道和VRAC介導Glu的釋放，同時使細胞內(nèi)線粒體Ca2+超載而造成神經(jīng)元功能障礙和細胞死亡；另一方面LINC00092-A2BP1軸介導的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)障礙，導致Glu的細胞外蓄積，兩方面共同導致神經(jīng)元的興奮性毒性.