匡婷, 李樂賽, 陳亦樂*

(1. 南華大學 研究生院臨床系， 湖南衡陽 421001； 2.湖南省腫瘤醫(yī)院 婦瘤科， 湖南長沙 410013)

卵巢癌作為全球女性致死率第一的婦科腫瘤，2019年約有22 500名新發(fā)卵巢癌患者，且有超過14 000例患者死于該疾病[1]，上皮性卵巢癌是最常見的一種卵巢癌類型，同時也是近年來婦科腫瘤的研究熱點.由于上皮性卵巢癌發(fā)病隱匿，70%的患者發(fā)現(xiàn)癌癥時已處于晚期或伴有多部位轉(zhuǎn)移，經(jīng)臨床一線治療后緩解的患者中,有55%～75%在2年內(nèi)復發(fā)[2]，且復發(fā)患者的10年無病生存率低于15%[3].因此，闡明上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的機制并加以干預，對于進一步提高上皮性卵巢癌的治療效果具有重要意義.近年來，因植物類提取的天然化合物具有高功效、低毒性等優(yōu)勢，故將其作為預防和治療包括癌癥在內(nèi)的許多疾病變得越來越受歡迎[4].

7-二氟甲氧基-5,4′-二甲氧基金雀異黃素(7-difluoromethoxy-5,4′-dimethoxygenistein, DFMG)是以金雀異黃素(genistein，GEN)為先導化合物，設計、合成和篩選得到的一種較先導化合物活性更高的新化學實體.國內(nèi)外報道DFMG具有抗炎[5]、抗動脈粥樣硬化斑塊的形成[6]、抗細胞凋亡[7]、抗內(nèi)皮細胞遷移[8]、抑制腫瘤血管新生[9]等藥理作用, 但目前國內(nèi)外尚無DFMG對卵巢上皮性癌細胞(skov3)細胞增殖、遷移侵襲及抗上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)作用機制的研究, 因此本文選用卵巢癌skov3,研究DFMG對其生物學行為的影響及初步機制探索,以期為DFMG用于卵巢癌治療提供相關(guān)理論基礎及實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源

卵巢癌細胞系skov3購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心.

1.1.2 主要試劑

RPMI 1640、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco公司); DFMG由湖南師范大學醫(yī)學院病理生理系提供; CCK-8試劑(唯贊公司);Transwell小室(美國Corning公司);基質(zhì)膠(美國BD公司);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA蛋白裂解液與苯甲基磺酰氟 (PMSF)(上海碧云天);BCA蛋白濃度測定試劑盒及蛋白上樣緩沖液、青霉素和鏈霉素溶液(北京索萊寶科技公司);兔抗人鈣粘附蛋白E(E-cadherin)多克隆抗體、兔抗人波形蛋白(vimentin)多克隆抗體、鼠抗人GAPDH多克隆抗體(武漢三鷹公司); E-cadherin、vimentin、GAPDH引物 (上海生工公司)；熒光二抗(北京中杉金橋生物公司).

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

skov3以RPMI 1640培養(yǎng)基加體積分數(shù)10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素,在體積分數(shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每日更換新鮮細胞培養(yǎng)液,細胞生長鋪滿80%瓶壁時, 胰酶消化傳代.

1.2.2 藥物制備

DFMG(自主合成,純度>99%,分子式為C18H14O5F2,相對分子質(zhì)量348,性狀為淡黃色晶體粉末)溶解于二甲基亞砜 (DMSO),并控制DMSO質(zhì)量濃度為0.1%, 在4 ℃存放.

1.2.3 CCK-8法檢測DFMG對skov3細胞增殖的影響

將skov3按5 000/孔細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后, 加入不同濃度 (0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)DFMG培養(yǎng)24 h后, 再加入CCK-8試劑, 37 ℃孵育1h后測得吸光度值并計算其增值抑制率；最后計算出DFMG對skov3的IC50，作為后續(xù)研究的藥物濃度.

1.2.4 劃痕實驗測定skov3遷移能力

skov3按1×107/mL的密度接種于6孔板，每孔1 mL細胞懸液, 至細胞融合率達80%左右時，使用200 μL槍頭尖端在單層細胞的中間刮出一條劃痕.PBS洗滌3次后,將skov3分為空白組、溶劑組(質(zhì)量濃度0.1% DMSO)、DFMG組，并根據(jù)不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3組細胞24 h后,顯微鏡(40×)下隨機選擇3個視野,計算劃痕面積遷移率,其公式為：遷移率=(ST0-ST24)/ST0×100%.

1.2.5 Transwell實驗檢測skov3的侵襲能力

使用24孔板及8 μm孔徑Transwell小室進行skov3細胞侵襲實驗.于冰上用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠 (V基質(zhì)膠∶V稀釋液=1∶8),取50 μL均勻覆蓋在上室, 37℃孵育1h使膠凝固.先消化細胞，再用無血清RPMI1640培養(yǎng)基終止消化且制備成密度為1×108/L的細胞懸液,取100 μL 懸液接種于Transwell上室,按不同條件培養(yǎng)3組skov3，即空白組、溶劑組、DFMG組.下室加入500 μL含有體積分數(shù)20%胎牛血清的生長培養(yǎng)基.在37 ℃下孵育48 h.PBS清洗上下室3次,固定并染色后在顯微鏡下觀察、計數(shù).

1.2.6 Western blotting檢測skov3不同處理組EMT的表達水平

將skov3按5×106/mL的密度種于6孔板,每孔1 mL,根據(jù)不同處理條件將skov3細胞分為:空白組、溶劑組、DFMG組，分別處理24 h后,收集各組細胞總蛋白,加入蛋白上樣緩沖液(5×)變性, 配制SDS-PAGE凝膠, 每孔蛋白上樣量約為15 μg, 開始電泳, 待溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳, 轉(zhuǎn)膜并封閉.隨后進行一抗 (E-cadherin/vimentin稀釋比例V抗體∶V稀釋液=1∶1 000;GAPDH稀釋比例V抗體∶V稀釋液=1∶10 000)和二抗(V抗體∶V稀釋液=1∶10 000)的孵育.最后用ECL類試劑和顯影儀來檢測蛋白.用Image J軟件測定光密度值分析E-cadherin和vimentin的蛋白相對表達量.

1.2.7 免疫熒光檢測skov3不同處理組EMT的表達水平

將處于對數(shù)增長期的skov3,制備密度成1×105/L的細胞懸液，接種于放有無菌玻片的12孔板中接種至含有玻璃片的24孔板內(nèi)，且按空白組、溶劑組、DFMG組分組培養(yǎng)24 h后.采用細胞免疫熒光染色法檢測skov3中EMT標志物E-cadherin、vimentin的表達,簡要步驟如下:細胞爬片后經(jīng)多聚甲醛溶液固定,即用Triton X-100室溫通透10 min,PBS沖洗5×3 min, BSA室溫下封閉30 min,兔抗人一抗E-cadherin (V抗體∶V稀釋液=1∶100)及vimentin (V抗體∶V稀釋液=1∶100) 4 ℃孵育過夜, PBS沖洗5×3 min, FITC標記羊抗兔二抗避光常溫孵育1 h，PBS沖洗5×3 min，DAPI復染核，再用PBS沖洗5×3 min.用甘油封片,激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照,對熒光染色結(jié)果進行定量分析.

1.2.8 qRT-PCR法檢測skov3不同處理組EMT相關(guān)基因表達

將skov3按1×106/mL的密度種于6孔板,每孔1 mL,根據(jù)不同處理條件將skov3分為:空白組、溶劑組、DFMG組，培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑提取各組細胞總RNA,紫外分光光度計檢測濃度及純度.應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)在美國Bio-Rad C1000 PCR儀上進行,每樣本設3個復孔,反應條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,58 ℃ 5 s,擴增40個循環(huán).基因表達情況采用2-ΔΔCt法進行相對表達量分析.

1.3 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3次，計量資料以(均數(shù)±標準差)表示.兩組間比較采用t檢驗,多組間均數(shù)比較采用方差分析,2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，用Graphpad prism 5.0軟件作圖.

2 結(jié)果

2.1 DFMG對skov3增值活性的影響

分別用濃度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的DFMG處理細胞24 h后，觀察細胞增值活力(圖1)，從DFMG濃度為40 μmol/L開始，細胞的增值活力明顯受抑制(P<0.05)，半數(shù)藥物抑制濃度(IC50)為(113.1±12.1)μmol/L,于是選取113 μmol/L DFMG濃度作為后續(xù)所有實驗的研究濃度(與空白對照組相比，溶劑組對細胞生長無抑制作用).

2.2 DFMG對skov3遷移與侵襲能力的影響

DFMG能降低skov3的遷移和侵襲的能力.在細胞傷口愈合實驗中，DFMG組細胞的遷移率均為32% 明顯低于于空白組64.33%(圖2A).在Transwell侵襲實驗中，DFMG組的侵襲細胞數(shù)量(78個細胞)顯著減少(圖2B)；結(jié)果與空白組(225個細胞)相比，差異統(tǒng)計學意義(P<0.05).

與空白組比較，1)P<0.05，2)P<0.01Compared with the blank group，1)P<0.05，2)P<0.01

與空白組比較，1)P<0.05Compared with the blank group，1)P<0.05A：劃痕實驗：檢測細胞遷移能力；B：Transwell實驗：檢測細胞侵襲能力.A：Wound healing test: detecting the migration ability of cells B：Transwell test: detecting the invasion ability of cells.

2.3 DFMG對skov3 EMT的影響

Western blot、細胞免疫熒光及qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,DFMG處理后的skov3與空白組相比，E-cadherin蛋白及mRNA表達均增高而vimentin蛋白及mRNA表達均顯著降低(P<0.05,圖3A、3B).

與空白組比較，1)P<0.05Compared with the blank group，1)P<0.05A、D：蛋白免疫印跡實驗和細胞免疫熒光實驗檢測EMT相關(guān)指標蛋白變化；B、C：qRT-PCR檢測EMT相關(guān)指標mRNA變化.A、D：Western blot and cellular immunofluorescence tests：detecting protein changes of EMT; B、C：qRT-PCR: detecting mRNA changes of EMT.

3 討論

GEN，一種植物類天然異黃酮化合物，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等功效. DFMG是其化學合成衍生物，且化學活性高于GEN.近年來有研究顯示：DFMG能通過抑制TLR4表達減少內(nèi)皮細胞的遷移能力[8]；DFMG能通過線粒體凋亡途徑促進宮頸癌細胞(hela)凋亡[10]；DFMG還可通過TLR4/NF-κB途徑顯著抑制白血病細胞血管新生[9]等.盡管DFMG目前抗腫瘤的分子機制研究不多，但把DFMG作為研發(fā)新的抗腫瘤藥仍具有廣泛的前景.

上皮性卵巢癌的死亡率已占據(jù)女性生殖器官惡性腫瘤首位，具有發(fā)病隱匿、高轉(zhuǎn)移性和易耐藥的特點，臨床治療常為：手術(shù)聯(lián)合化療的標準治療方案并輔以靶向及免疫治療，但其治療效果仍差，5年生存率低于30%[11].因此，發(fā)現(xiàn)新的靶分子或藥物可為提高卵巢癌治療及預后提供更好的研究方向.EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步[12].近年來越來越多的研究將逆轉(zhuǎn)EMT作為抗卵巢癌轉(zhuǎn)移的重要研究方向[13-15].

EMT是指在某些生理和病理狀態(tài)下出現(xiàn)的上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，細胞間的粘附力降低，而癌細胞的遷移、侵襲能力增加[16]；在這個過程中，上皮細胞發(fā)生去上皮化、喪失極性，上皮細胞的標志分子(E-cadherin、ZO-1等)表達逐步下降，而細胞骨架重構(gòu)、細胞形態(tài)改變，表達間質(zhì)性細胞的標志分子(如：vimetin、N-cadherin等)增加[17-19].隨著正常細胞、組織形態(tài)及構(gòu)架被打破，為癌細胞的轉(zhuǎn)移與復發(fā)提供了合適的環(huán)境，因此，開發(fā)有效抑制上皮性卵巢癌EMT過程的藥物具有重要意義.

目前，植物提取物的抗腫瘤EMT作用逐步受到關(guān)注[20].植物提取物具有原料容易獲得、價格較為便宜、非人工合成的獨特優(yōu)勢，一直是治療藥物的來源和藥物加工的基礎.本實驗通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)濃度為40 μmol/L的DFMG開始顯著抑制卵巢癌skov3的增殖能力,并存在濃度依賴性，IC50為(113.1±12.1)μmol/L.細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)卵巢癌skov3細胞的遷移率受DFMG抑制,且均具有統(tǒng)計學意義.進一步行Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)113 μmol/L DFMG處理后的細胞穿過小室的細胞明顯少于對照組,DFMG顯著抑制卵巢癌skov3的遷移、侵襲能力.為探討DFMG抑制卵巢癌skov3的體外增殖和遷移、侵襲能力的機制,本研究進一步進行Western Blot、細胞免疫熒光和qRT-PCR實驗法檢測E-cadherin、vimentin蛋白和mRNA的表達,結(jié)果顯示,DFMG處理后的skov3 E-cadhein的蛋白和mRNA增高，而vimentin的蛋白和mRNA減少.這一結(jié)果提示DFMG抑制卵巢癌skov3的體外增殖和遷移、侵襲能力,可能與其逆轉(zhuǎn)癌細胞EMT有關(guān).

綜上所述,本實驗證實了DFMG能抑制skov3增殖、遷移和侵襲能力，可能與其逆轉(zhuǎn)癌細胞EMT有關(guān).這可為下一步尋找卵巢癌的新療法提供一定的理論基礎及實驗依據(jù)，但其更為詳細的調(diào)節(jié)機制有待進一步探討.