李蘭蘭, 付生軍, 陶燕, 劉善輝, 張靜, 盧建中

(1.蘭州大學(xué) 第二醫(yī)院甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué) 第二醫(yī)院甘肅省泌尿系疾病臨床醫(yī)學(xué)中心, 甘肅 蘭州 730030)

能量代謝作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的特征之一在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用.正常細(xì)胞在有氧環(huán)境中主要依靠線粒體氧化磷酸化代謝葡萄糖產(chǎn)能，低氧環(huán)境會(huì)迫使糖代謝轉(zhuǎn)向糖酵解.而腫瘤細(xì)胞即使在有氧環(huán)境下均以糖酵解為主要能量來源，即有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)[1].糖酵解的第一個(gè)限速酶己糖激酶(hexokinase, HK)催化葡萄糖代謝的第一步，可磷酸化底物葡萄糖為6-磷酸葡萄糖.HK催化的反應(yīng)中間產(chǎn)物也是調(diào)節(jié)糖代謝和其他生物合成途徑的一個(gè)焦點(diǎn)，因此HK成為調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn).多種癌癥細(xì)胞可通過上調(diào)己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)表達(dá)來改變癌細(xì)胞糖代謝.腫瘤中葡萄糖代謝率升高、腫瘤進(jìn)展和高死亡率主要與HK2過度表達(dá)有關(guān)[2].HK2的上調(diào)會(huì)促進(jìn)不同腫瘤細(xì)胞的化療抵抗和轉(zhuǎn)移[3]，使HK2成為抑制腫瘤細(xì)胞糖代謝的重要靶點(diǎn).為了探究HK2在泌尿系腫瘤中的作用，本文使用基因表達(dá)數(shù)據(jù)集分析泌尿系統(tǒng)腫瘤中HK2表達(dá)與腫瘤分期分級(jí)、腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系.進(jìn)一步分析HK2表達(dá)水平與腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性、免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性及與腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性.

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)分析

HK2基因在不同癌癥類型中的表達(dá)水平使用Oncomine數(shù)據(jù)庫[4]中數(shù)據(jù)集分析.分析過程中概率(p)和變化倍數(shù)(FC)閾值分別設(shè)置為0.05和1.5.

1.2 生存分析

HK2基因在不同癌癥病人的生存曲線，使用Kaplan-Meier在線繪圖工具產(chǎn)生[5].該網(wǎng)站包含了基因表達(dá)、癌癥基因組圖譜(TCGA)和癌癥生物醫(yī)學(xué)信息網(wǎng)格組裝微陣列基因表達(dá)信息和存活等數(shù)據(jù)集信息.根據(jù)目的基因表達(dá)水平將癌癥病人分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，對(duì)其總生存率(OS)和無進(jìn)展生存(PFS)進(jìn)行分析，計(jì)算95%置信區(qū)間(CI)的風(fēng)險(xiǎn)比(HR).使用log-rank法計(jì)算兩組患者的生存曲線之間的差異.

1.3 腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)估

HK2表達(dá)與膀胱癌(BLCA)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)和前列腺癌(PRAD)中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性及與免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性使用TIMER[6]分析，同時(shí)也分析了HK2表達(dá)水平與腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性.HK2表達(dá)和腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的分子標(biāo)記物表達(dá)之間的相關(guān)性使用TIMER的相關(guān)性模塊分析獲得.

1.4 GEPIA分析

HK2在泌尿系腫瘤表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平相關(guān)性分析借助GEPIA在線工具(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)的單基因分析工具中Correlation模塊分析獲得.

2 結(jié)果

2.1 HK2 mRNA表達(dá)水平

HK2在不同腫瘤和癌旁組織中mRNA表達(dá)差異水平如圖1所示.與正常癌旁組織相比，HK2在膀胱癌(BLCA)、膽管癌(CHOL)、食管癌(ESCA)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)、肺鱗癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、胃癌(STAD)、甲狀腺癌(THCA)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)等大多數(shù)癌癥組織中表達(dá)顯著上調(diào).僅在結(jié)腸癌(COAD)、腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)、肺腺癌(LUAD)和直腸腺癌(READ)中表達(dá)顯著下調(diào).

4種泌尿系腫瘤(BLCA、KIRC、KIRP和PRAD)中HK2表達(dá)水平與腫瘤分期分級(jí)的關(guān)系如在圖2，其中前列腺癌分級(jí)采用Gleason score.在BLCA中，HK2表達(dá)隨著腫瘤分級(jí)增加而降低，提示HK2在進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移膀胱癌中發(fā)揮不同的作用.HK2表達(dá)在不同分級(jí)KIRC中變化不大.在KIRP和PRAD中，HK2在最高級(jí)別腫瘤中均顯著高于低級(jí)別腫瘤，提示HK2參與促進(jìn)癌癥進(jìn)展或轉(zhuǎn)移.

圖1 不同癌癥中HK2基因mRNA表達(dá)情況.(A) Oncomine數(shù)據(jù)庫中HK2基因在不同癌癥和癌旁組織中表達(dá)水平.(B)使用TIMER網(wǎng)站繪制的TCGA數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤類型中HK2的mRNA表達(dá)水平. 1)P<0.05， 2)P<0.01， 3)P<0.001.

2.2 HK2表達(dá)水平與癌癥患者預(yù)后不良相關(guān)

Kaplan-Meier中分析的HK2表達(dá)與癌癥患者預(yù)后的生存曲線如圖3.從圖中可以看出HK2的表達(dá)水平與泌尿系腫瘤患者的總生存期顯著相關(guān)，logrankp均小于0.05.在BLCA和KIRC中，HK2基因低表達(dá)患者的OS顯著低于高表達(dá)患者，p分別為0.009 6和0.002，HR分別為0.67(0.5～0.91)和0.56(0.38～0.81)；PFS在HK2低表達(dá)患者同樣低于高表達(dá)患者，p為0.087和0.21，HR分別為0.55(0.27～1.1)和0.52(0.19～1.45)，提示HK2低表達(dá)可能是BLCA和KIRC患者的不良預(yù)后因子.而KIRP中，HK2高表達(dá)患者的OS和PFS顯著低于HK2低表達(dá)患者，p分別為0.024和0.039，HR分別為1.99(1.08～3.65)和2.76(1.02～7.5)，提示HK2高表達(dá)不利于KIRP患者預(yù)后.

圖2 HK2基因在泌尿系腫瘤不同分級(jí)分期表達(dá)水平.(A)膀胱癌；(B)腎透明細(xì)胞癌；(C)腎乳頭狀細(xì)胞癌；(D)前列腺癌.

圖3 HK2表達(dá)水平與泌尿系腫瘤的總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)關(guān)系.

2.3 HK2表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)

泌尿系腫瘤中HK2表達(dá)與6種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性如圖4.可看出HK2在幾種泌尿系腫瘤的表達(dá)水平與腫瘤純度無明顯相關(guān)性.BLCA和KIRP中HK2表達(dá)水平與多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平無明顯相關(guān)性，BLCA中僅與巨噬細(xì)胞(Macrophages)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.135，P=9.92e-3)，而KIRP中與中性粒細(xì)胞(Neutrophils)和樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells)呈顯著正相關(guān)，r和P分別為0.169和0.18，P分別為6.39e-3和3.93e-3.KIRC中，HK2表達(dá)水平與多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān)，如B細(xì)胞(r=0.315，P=4.61e-12)、巨噬細(xì)胞(r=0.28，P=1.71e-9)、中性粒細(xì)胞(r=0.377，P=6.85e-17)和樹突狀細(xì)胞(r=0.302，P=4.84e-11)；而與CD4+T細(xì)胞(r=0.13，P=5.37e-3)和CD8+T細(xì)胞(r=0.166，P=4.90e-4)免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)性不高.PRAD中HK2表達(dá)與CD8+T細(xì)胞(r=0.35，P=1.93e-13)、中性粒細(xì)胞(r=0.216，P=9.41e-6)和樹突狀細(xì)胞(r=0.233，P=1.54e-6)浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān)，而與CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)，但無明顯差異(r=-0.075，P=1.30e-1).

圖4 泌尿系腫瘤中HK2表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)性分析.(A) BLCA；(B) KIRC；(C) KIRP；(D) PRAD.

2.4 HK2表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平相關(guān)性分析

HK2表達(dá)水平與一些免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平之間的相關(guān)性結(jié)果見表1.BLCA中HK2表達(dá)水平與多數(shù)免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，如單核細(xì)胞(CD86)和M2型巨噬細(xì)胞(CD163、MS4A4A)；與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)的標(biāo)志物CCL2和IL10呈負(fù)相關(guān)，但無明顯差異.而與M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物NOS2和PTGS2呈顯著正相關(guān).在KIRC和PRAD中，HK2表達(dá)水平與大部分免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)呈顯著正相關(guān)，如CD86、CD115、CD68、IL10、VSIG4和MS4A4A等.而在KIRP中,HK2表達(dá)水平只與CD68、NOS2、PTGS2和CD163的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，與其他標(biāo)志物表達(dá)呈正相關(guān)但無顯著差異.

2.5 HK2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境相關(guān)性分析

分析HK2表達(dá)水平與腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，KIRP和PRAD中HK2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境(ESTIMATEScore)無明顯相關(guān)性，包括ImmuneScore和StromalScore.而BLCA和KIRC中HK2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境呈顯著正相關(guān)，ESTIMTEScore的r分別為0.2和0.135，P值為4.77e-5和0.001 9.其中，BLCA中HK2表達(dá)與ImmuneScore和StromalScore呈顯著負(fù)相關(guān)，r分別為-0.152和-0.217，P分別為0.002 05和1.02e-5；而KIRC中HK2表達(dá)僅與StromalScore呈顯著正相關(guān)，r和P分別為0.179和3.6e-5，與ImmuneScore無明顯相關(guān)性(圖5).

表1 HK2表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性Table 1 The correlation between expression level of HK2 and immune cell markers

圖5 BLCA、KIRC、KIRP和PRAD中HK2表達(dá)水平與腫瘤微環(huán)境中ESTIMATEScore (A)、ImmuneScore (B)和StromalScore (C)的相關(guān)性.

3 討論

腎癌、膀胱癌和前列腺癌是最常見的泌尿系3大腫瘤，均具有較高的發(fā)病率和病死率，早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療和預(yù)后預(yù)測(cè)可以顯著改善患者的生命質(zhì)量.目前對(duì)泌尿系腫瘤的手術(shù)、放化療等綜合治療已獲得相當(dāng)?shù)寞熜?，但存在手術(shù)治療復(fù)發(fā)率高、放療和化療不良反應(yīng)較大、放化療耐藥和轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等問題，對(duì)進(jìn)展期和晚期腫瘤的治療結(jié)果仍不甚理想，急需開展新的研究，發(fā)現(xiàn)有效的診斷標(biāo)志物和診斷方法.

HK2作為HK組織特異性同工酶亞型之一，是催化糖酵解途徑的第一個(gè)限速酶，在多種腫瘤組織中過表達(dá)并參與腫瘤中過度糖酵解過程[7].HK2過表達(dá)促進(jìn)糖酵解并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過程.在一些癌癥中HK2對(duì)線粒體的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)，線粒體結(jié)合能降低線粒體外膜的通透性，增強(qiáng)HK2的酶催化活性，促進(jìn)更多的葡萄糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸葡萄糖而進(jìn)一步促進(jìn)糖酵解作用[8].腫瘤細(xì)胞中過度的糖酵解產(chǎn)生大量乳酸造成腫瘤微環(huán)境的酸化，成為癌癥進(jìn)化和惡性進(jìn)展的關(guān)鍵誘因，同時(shí)酸化的微環(huán)境加大了進(jìn)化選擇壓力，進(jìn)一步促進(jìn)了侵略性和抗藥性的出現(xiàn)[9].然而，在癌細(xì)胞中下游糖酵解活性被減弱以便將葡萄糖轉(zhuǎn)移到分支代謝途徑中，而關(guān)于HK2的研究發(fā)現(xiàn)，HK2催化的葡萄糖代謝最上游活性的增加對(duì)于將葡萄糖轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞的這些分支途徑中至關(guān)重要[10].與具有一個(gè)酶催化活性的HK1和HK3相比，HK2的N端和C端結(jié)構(gòu)域均具有催化活性，因此具有更高的催化能力.而癌細(xì)胞中合成代謝的加速需要更強(qiáng)大的HK活性，因此需要誘導(dǎo)更多HK2的表達(dá).因此，癌細(xì)胞與正常細(xì)胞相比表達(dá)高水平的HK2.HK2高表達(dá)與膽囊腫瘤惡性程度和預(yù)后不良呈顯著相關(guān)，下調(diào)HK2表達(dá)可顯著抑制膽囊癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)葡萄糖消耗和細(xì)胞乳酸產(chǎn)量大大降低[11].對(duì)肝細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，敲除HK2可抑制癌細(xì)胞中糖酵解而促進(jìn)氧化磷酸化水平，同時(shí)提高癌細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性[12].在HK2高表達(dá)HK1低表達(dá)的膀胱癌UMUC-3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，抑制劑可減少細(xì)胞葡萄糖消耗水平、減少下游代謝產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生，同時(shí)抑制細(xì)胞中糖酵解水平[13].一些HK2的抑制劑，諸如2-脫氧葡萄糖、3-溴丙酮酸等可抑制多種腫瘤細(xì)胞的糖酵解作用而顯現(xiàn)出抗癌作用[14]，以上均提示HK2可作為有效的抗癌靶點(diǎn).

HK2是乳腺癌[15]、喉鱗狀細(xì)胞癌[16]、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[17]和胃腺癌[18]的潛在預(yù)后標(biāo)志物.而泌尿系腫瘤中HK2表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)性的研究較少.本文討論了HK2在泌尿系腫瘤中的作用，Oncomine和TIMER數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)，HK2在BLCA、KIRC、KIRP和PRAD等泌尿系腫瘤中顯著高表達(dá).在BLCA中HK2隨著腫瘤分級(jí)升高表達(dá)降低；KIRC中HK2表達(dá)不隨腫瘤分級(jí)變化；而高級(jí)別KIRP和PRAD中HK2表達(dá)顯著高于低級(jí)別腫瘤.生存分析發(fā)現(xiàn)，HK2表達(dá)水平與BLCA、KIRC和KIRP患者的預(yù)后顯著相關(guān).進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HK2表達(dá)水平與泌尿系腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平、腫瘤微環(huán)境中stromal評(píng)分和immune評(píng)分、免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平相關(guān).在結(jié)直腸癌和胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，HK2低表達(dá)的患者預(yù)后更差，具有更短的無進(jìn)展生存期和總生存期[2, 19]，這一結(jié)果與我們分析的HK2在結(jié)直腸癌和胰腺癌組織中表達(dá)降低是一致的.此外，包括HK2在內(nèi)的糖酵解相關(guān)基因介導(dǎo)了腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平及免疫治療抵抗過程.Peng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中糖酵解通路與黑色素瘤的免疫抵抗相關(guān).骨髓中性粒細(xì)胞缺乏免疫抑制活性，患有早期癌癥小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞能更多地自發(fā)遷移至組織，同時(shí)伴隨著氧化磷酸化和糖酵解速率的增加及ATP產(chǎn)量的增高[21].這一現(xiàn)象與本研究觀察的KIRC、KIRP和PRAD中HK2表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)是吻合的.蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)減少與高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腫瘤中糖酵解增加之間具有相關(guān)性，提示靶向糖酵解通路是克服腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抵抗的潛在治療策略[22].

綜上所述，HK2表達(dá)上調(diào)促進(jìn)糖酵解參與泌尿系腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，其在不同泌尿系腫瘤中發(fā)揮不同作用，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究，并探究出更有效的治療方案.總的來說，通過抑制HK2表達(dá)來降低糖酵解水平可為靶向HK2進(jìn)行泌尿系腫瘤治療提供理論指導(dǎo).