李冠睿, 李建武, 顏家渝,3*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 四川 成都 610072； 2.臨沂市中醫(yī)醫(yī)院, 山東 臨沂 276003； 3.成都中醫(yī)藥大學(xué) 附屬?gòu)V安醫(yī)院/廣安市中醫(yī)醫(yī)院, 四川 廣安 638600)

口腔鱗癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，口腔鱗癌發(fā)病率與死亡率逐年升高，隨著抗腫瘤藥物的研發(fā)，口腔鱗癌患者復(fù)發(fā)率及生存率仍較低.口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是降低治療效果及造成患者預(yù)后不良的重要原因之一[1],因而探究口腔鱗癌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的方法成為研究重點(diǎn).非編碼RNA主要包括微小RNA(micro RNA,miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)，研究報(bào)道指出非編碼RNA在口腔鱗癌中異常表達(dá)，可對(duì)腫瘤細(xì)胞化療耐藥性產(chǎn)生重要作用，還可調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡等過(guò)程[2-4].LncRNA LINC00478在乳腺癌中表達(dá)水平降低，可能參與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[5].但LINC00478在口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥性中的作用尚未可知.生物信息學(xué)分析顯示miR-214可能是LINC00478的靶基因，miR-214在口腔鱗癌中表達(dá)水平升高，可促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲[6].但LINC00478是否可通過(guò)靶向調(diào)控miR-214從而影響口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥尚未可知.因此，本研究主要探討LINC00478對(duì)口腔鱗癌順鉑耐藥性細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探究其對(duì)miR-214的靶向調(diào)控作用，為口腔鱗癌化療藥物耐藥的防治提供新方向.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口腔鱗癌組織與癌旁組織標(biāo)本來(lái)源：選取2017年3月至2018年10月本院收治的28例口腔鱗癌患者為研究對(duì)象，其中男18例，女10例，年齡50～70歲，平均年齡(63.25±8.52)歲，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為口腔鱗癌，術(shù)中切除口腔鱗癌組織、癌旁組織，置于液氮中保存.

口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；MTT試劑、DMSO、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；pcDNA 3.1購(gòu)自上海澤葉生物有限公司；miR-214寡核苷酸模擬物(miR-214 mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔抗人Ki67、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

耐藥細(xì)胞株CAL-27/DDP的誘導(dǎo)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CAL-27細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%時(shí)加入質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至正常狀態(tài)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，加入含有質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，后續(xù)過(guò)程中逐步提高順鉑質(zhì)量濃度直至細(xì)胞不耐受，最終獲得能耐受質(zhì)量濃度1 mg/L順鉑的穩(wěn)定耐藥細(xì)胞株，記作CAL-27/DDP細(xì)胞[7].取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CAL-27/DDP細(xì)胞，分別將pcDNA、pcDNA-LINC00478、pcDNA-LINC00478與miR-NC、pcDNA-LINC00478與miR-214 mimics轉(zhuǎn)染至CAL-27/DDP細(xì)胞，分別記作pcDNA組、pcDNA-LINC00478組、pcDNA-LINC00478+miR-NC組、pcDNA-LINC00478+miR-214組.

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中LINC00478、miR-214的表達(dá)水平

取凍存口腔鱗癌組織、癌旁組織、CAL-27細(xì)胞、CAL-27/DDP細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后各組CAL-27/DDP細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量.反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min.反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36次循環(huán).LINC00478以GAPDH為內(nèi)參，miR-214以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00478、miR-214相對(duì)表達(dá)量.

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取各組CAL-27/DDP細(xì)胞接種于96孔板(1×104/孔)，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，分別加入150 μL DMSO，室溫避光孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(D值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(D對(duì)照組-D實(shí)驗(yàn)組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100%.

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取各組CAL-27/DDP細(xì)胞接種于6孔板(5×104/孔)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，加入預(yù)冷PBS洗滌，分別加入500 μL甲醇，置于-20 ℃冰箱內(nèi)孵育20 min，棄甲醇，每孔加入400 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%結(jié)晶紫染色液，室溫孵育15 min，回收結(jié)晶紫染色液，采用流動(dòng)水洗滌3 min，晾干，拍照.

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取各組CAL-27/DDP細(xì)胞，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化，加入PBS清洗，棄上清，分別加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒分別加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μL PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率.

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00478與miR-214靶向關(guān)系

LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示LINC00478與miR-214的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型載體WT-LINC00478與突變型載體MUT-LINC00478，分別將WT-LINC00478、MUT-LINC00478與miR-NC、miR-214 mimics共轉(zhuǎn)染至CAL-27/DDP細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性.

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)Ki67、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

取各組CAL-27/DDP細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度.蛋白樣品中加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗稀釋液(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，分別加入二抗稀釋液(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LINC00478、miR-214在口腔鱗癌中的表達(dá)

與癌旁組織比較，口腔鱗癌組織LINC00478的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-214的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(表1).與CAL-27組比較，CAL-27/DDP組LINC00478的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-214的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(表2).

2.2 各個(gè)分組處理的CAL-27/DDP細(xì)胞抑制率

與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00478組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-LINC00478+miR-NC組比較，pcDNA-LINC00478+miR-214組細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)(表3).

表1 LINC00478、miR-214在口腔鱗癌組織中的表達(dá)

表2 LINC00478、miR-214在CAL-27和CAL-27/DDP中的表達(dá)

表3 各個(gè)分組處理CAL-27/DDP細(xì)胞抑制率的檢測(cè)

2.3 各個(gè)分組處理的CAL-27/DDP克隆形成數(shù)

與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00478組克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.05)；與pcDNA-LINC00478+miR-NC組比較，pcDNA-LINC00478+miR-214組克隆形成數(shù)顯著增多(P<0.05)(圖1、表4).

2.4 各個(gè)分組處理的CAL-27/DDP凋亡率

與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00478組凋亡率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-LINC00478+miR-NC組比較，pcDNA-LINC00478+miR-214組凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖2、表5).

圖1 克隆形成數(shù)的檢測(cè)

表4 各個(gè)分組處理CAL-27/DDP克隆形成數(shù)的檢測(cè)

表5 各個(gè)分組處理的CAL-27/DDP凋亡率的檢測(cè)

圖2 凋亡率的檢測(cè)

2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00478與miR-214靶向關(guān)系

LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示LINC00478與miR-214存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3).雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-214能夠抑制WT-LINC00478熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)MUT-LINC00478熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)(表6).與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00478組miR-214的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(表7).

2.6 Western blot檢測(cè)各個(gè)分組處理CAL-27/DDP中蛋白的表達(dá)

與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00478組Ki67、Pro-caspase3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase3蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-LINC00478+miR-NC組比較，pcDNA-LINC00478+miR-214組Ki67、Pro-caspase3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase3蛋白水平顯著降低(P<0.05)(圖4、表8).

圖3 LINC00478靶向miR-214

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Table 6 Double luciferase report experiment

表7 miR-214的表達(dá)水平Table 7 Expression of miR-214

圖4 Ki67、caspase3蛋白的表達(dá)

表8 各個(gè)分組處理CAL-27/DDP中蛋白的表達(dá)Table 8 The expression of protein in CAL-27/DDP processed by each group

3 討論

口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥過(guò)程與miRNA及多種基因異常表達(dá)密切相關(guān)，既往研究顯示miRNA在口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥性中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8-10].但LncRNA在口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥性過(guò)程中的作用機(jī)制尚未闡明.

LINC00478在乳腺癌組織中表達(dá)水平降低，并可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA從而參與乳腺癌發(fā)生過(guò)程[11].本研究結(jié)果顯示口腔鱗癌組織LINC00478的表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步分析顯示順鉑耐藥細(xì)胞CAL-27/DDP中LINC00478的表達(dá)水平顯著降低，提示LINC00478在口腔鱗癌發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮抑癌基因作用，還可能作為逆轉(zhuǎn)口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥性的關(guān)鍵基因.本研究結(jié)果顯示LINC00478過(guò)表達(dá)可明顯提高細(xì)胞增殖抑制率及減少克隆形成數(shù)，提示LINC00478過(guò)表達(dá)可抑制CAL-27/DDP細(xì)胞增殖.研究表明Ki67在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[12].本研究結(jié)果顯示LINC00478過(guò)表達(dá)可抑制Ki67表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)LINC00478過(guò)表達(dá)可減弱CAL-27/DDP細(xì)胞增殖能力.caspase3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，當(dāng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活后Pro-caspase3生成量減少，而Cleaved-caspase3生成量增多從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13].本研究結(jié)果顯示LINC00478過(guò)表達(dá)后CAL-27/DDP細(xì)胞凋亡率明顯升高，Pro-caspase3表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，提示LINC00478過(guò)表達(dá)可促進(jìn)CAL-27/DDP細(xì)胞凋亡.

LncRNA HOXA11-AS通過(guò)抑制miR-214-3p表達(dá)而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及順鉑耐藥性[14].HOTAIR/miR-214/ST6GAL1通路可抑制結(jié)直腸癌發(fā)展進(jìn)程[15].LncRNA LINC01535通過(guò)靶向miR-214/EZH2分子軸而促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展[16].miR-214-3p通過(guò)靶向ST6GAL1而調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移[17].本研究結(jié)果顯示口腔鱗癌組織中miR-214的表達(dá)水平升高，CAL-27/DDP細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平升高，提示miR-214表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)口腔鱗癌發(fā)生，還可能降低細(xì)胞順鉑敏感性.本研究采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC00478能夠靶向結(jié)合miR-214，并可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-214從而負(fù)向調(diào)控其表達(dá).本研究將pcDNA-LINC00478與miR-214 mimics共轉(zhuǎn)染至CAL-27/DDP細(xì)胞，結(jié)果顯示增殖抑制率、凋亡率明顯降低，克隆形成數(shù)明顯增多，并可抑制Cleaved-caspase3表達(dá)及促進(jìn)Ki67、Pro-caspase3表達(dá)，提示miR-214過(guò)表達(dá)可降低LINC00478過(guò)表達(dá)對(duì)CAL-27/DDP細(xì)胞增殖及凋亡的作用.

綜上所述，LINC00478過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向抑制miR-214表達(dá)而抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而降低細(xì)胞順鉑耐藥性，LINC00478可能作為增強(qiáng)口腔鱗癌細(xì)胞順鉑敏感性的關(guān)鍵基因，并可能作為口腔鱗癌靶向治療的潛在靶點(diǎn).但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需深入探究.