周晴接 孟飛 朱麗明 蔣曉芬 朱方超 潘杰

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）是消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴組織樣淋巴瘤的主要致病因子，根除Hp對治療和預防上述疾病具有重要意義[1]。然而，隨著抗生素的廣泛使用，Hp對常用抗生素的耐藥率越來越高，傳統(tǒng)Hp根除治療方案的根除率越來越低。目前Hp根除治療失敗的原因包括抗生素的選擇、患者依從性、地區(qū)因素、宿主因素、質(zhì)子泵抑制劑（PPI）代謝等，其中細菌耐藥是最主要的原因。因此，如何正確選擇抗生素并制定個體化治療方案是根治Hp的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)Hp的耐藥性與其相應(yīng)的基因耐藥位點相關(guān)，如23S rRNA基因（克拉霉素耐藥位點）、gyrA基因（喹諾酮耐藥位點）等，通過對Hp進行耐藥基因測序，即可得到該耐藥位點的信息，從而推斷出耐藥情況[2-3]。本研究通過雙脫氧鏈終止法（PCR-Sanger）測序檢測Hp并獲得耐藥基因23S rRNA與gyrA的突變情況，推斷出Hp對克拉霉素與左氧氟沙星的耐藥情況，從而選擇敏感抗生素進行個體化治療，以期提高Hp的根除率。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1至6月因各種消化道癥狀于溫州市中心醫(yī)院就診且13C尿素呼氣試驗陽性提示存在Hp感染的患者200例，依據(jù)“第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告”推薦[4]，所有患者均符合Hp根除治療指征。納入標準：（1）年齡18～70歲，男女不限，均為初治患者；（2）因腹痛、腹脹、反酸、噯氣、惡心、嘔吐、燒心、胸痛、嘔血、黑便等各種不適癥狀就診；（3）4周內(nèi)未使用抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑或PPI制劑；（4）同意行胃鏡檢查取胃黏膜活檢組織標本進行Hp PCRSanger測序、細菌培養(yǎng)及藥敏試驗；（5）同意進行Hp根除治療，并愿意配合醫(yī)生進行根除療效的隨訪調(diào)查。排除標準：（1）嚴重心、肝、腎功能損害者；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）有上消化道活動性出血、穿孔、幽門梗阻、癌癥并發(fā)癥者；（4）有食管、胃腸手術(shù)史者；（5）患者不能正確表達自己的主訴，如精神病、嚴重神經(jīng)官能癥者；（6）同時服用非甾體抗炎藥或酗酒者；（7）對阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、呋喃唑酮等4種抗生素任一種過敏者。將所有患者按隨機數(shù)字表法分為個體化治療組與經(jīng)驗治療組兩組，每組100例。本研究經(jīng)溫州市中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 標本采集 常規(guī)胃鏡檢查后選擇胃竇小彎側(cè)距幽門5 cm內(nèi)的黏膜深部組織，在相近部位（1 cm以內(nèi)）取3塊胃黏膜組織，分別用于Hp PCR-Sanger測序、細菌培養(yǎng)及組織病理學檢查。

1.3 Hp檢測方法

1.3.113C尿素呼氣試驗 空腹或禁食2 h以上的患者正常吹氣至氣袋飽滿（0 min呼氣）；之后，徹底漱口并服用13C尿素顆粒，靜坐30 min再次收集氣體（30 min呼氣）；分別對兩次呼氣的13CO2進行檢測，并依據(jù)兩次檢測值差值判定患者呼氣試驗結(jié)果。檢測值≥4.0判定為陽性，＜4.0判定為陰性。

1.3.2 PCR-Sanger測序 （1）全基因組提?。簩⑽葛つそM織研磨后采用美國Life Technologies公司的Invitrogen Purelink Genomic DNA Mini Kit試劑盒進行人和細菌的全基因組提取，12 000 r/min離心3 min，去除上清液，加入專用裂解液和鋼珠進行細胞破碎，隨后95℃金屬浴10 min，結(jié)束后立即放入4℃冰箱冷卻30 min，最后12 000 r/min離心10 min，吸出上清液即為全基因組，提取到Hp全基因組斷定為陽性，否則判定為陰性。（2）耐藥基因擴增：使用23S rRNA和gyrA基因引物（表1）對耐藥基因23S rRNA和gyrA進行PCR擴增。（3）Sanger測序：使用3730XL測序儀對23S rRNA和gyrA基因的PCR產(chǎn)物進行測序。（4）耐藥基因測序結(jié)果分析：采用chromas和Sequencing Analysis5.2軟件進行序列分析，得出Sanger測序峰圖，對每個樣本的23S rRNA（A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C），gyrA（Asn87Lys、Ala88Val、Asp91Gly/Asn/Ala/Tyr）突變位點進行分析，給出耐藥性，突變判定為耐藥，未突變判定為敏感（圖1-4，插頁）。

圖1 克拉霉素未突變株測序圖

圖2 克拉霉素A2143G純合突變株測序圖

圖3 喹諾酮類81位未突變、Asn91位未突變株測序圖

圖4 喹諾酮類Asn87Lys雜合突變、91位未突變株測序圖

1.3.3 細菌培養(yǎng)及藥敏試驗 （1）Hp分離培養(yǎng)：胃黏膜組織經(jīng)充分研磨后，接種于哥倫比亞血瓊脂平板（5%脫纖維綿羊血），37 ℃三氣培養(yǎng)箱中（5% O2、10% CO2、85% N2）微需氧環(huán)境下培養(yǎng) 96 h；（2）Hp鑒定：可疑菌落經(jīng)肉眼觀察、革蘭染色鏡檢、尿素酶試驗、過氧化氫酶和過氧化物酶試驗陽性者，為Hp菌株，判定為陽性，否則判定為陰性。（3）Hp藥敏試驗：根據(jù)美國實驗室標準化協(xié)會推薦方法，采用耐藥臨界點藥物瓊脂稀釋法進行藥敏試驗，將抗生素溶液加入瓊脂中稀釋成相應(yīng)的臨界點濃度，傾注平板，接種菌懸液，若接種點有菌生長則該菌株判定為耐藥，否則判定為敏感。

表1 耐藥基因測序引物序列

1.4 分組處理 個體化治療組所有患者均予行胃鏡檢查及病理活檢，并同時行Hp PCR-Sanger測序、細菌培養(yǎng)及藥敏試驗，對比分析測序法與細菌培養(yǎng)法檢測Hp的陽性率及藥敏結(jié)果；測序陽性患者予測序方案治療（抗生素選擇阿莫西林+克拉霉素與左氧氟沙星中任一敏感者，如均耐藥，則選擇呋喃唑酮），即艾司奧美拉唑腸溶片（耐信片：中國阿斯利康制藥有限公司，國藥準字H20046379，20 mg/7 片/盒）1 片/次，2 次/d＋膠體果膠鉍膠囊（膠體果鉍膠囊：山西振東安特生物制藥有限公司，國藥準字 H20058476，100 mg/48 片/盒）2 片/次，2次/d＋阿莫西林膠囊（阿莫仙：珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，國藥準字 H44021351，250 mg/24 片/盒）4 片/次，2次/d＋克拉霉素緩釋片（諾邦：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20031041，500 mg/3 片/盒）1片/次，2次/d或左氧氟沙星片（可樂必妥：北京第一三共制藥有限公司，國藥準字 H20040091，500 mg/4 片/盒）1 片/次，1 次/d或呋喃唑酮片（痢特靈：上海金不換蘭考制藥有限公司，國藥準字 H41021628，100 mg/100 片/瓶）1 片/次，2 次/d。經(jīng)驗治療組患者未行PCR-Sanger測序，其余檢測方法相同，給予經(jīng)驗方案治療，即艾司奧美拉唑腸溶片1片/次，2次/d＋膠體果膠鉍膠囊2片/次，2次/d＋阿莫西林膠囊4 片/次，2次/d＋克拉霉素緩釋片 1片/次，2次/d。兩組患者療程均為14 d，停藥后4～8周后復查13C呼氣試驗確定Hp是否已根除成功。治療過程中對所有患者進行隨訪，記錄患者的基本信息、檢查結(jié)果、用藥情況、藥物不良反應(yīng)及Hp根除治療結(jié)果，對比分析兩組患者的Hp根除率。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用意向性分析（ITT）與遵循研究方案分析（PP）評價療效；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Kappa檢驗對個體化治療組PCR-Sanger測序與藥敏試驗結(jié)果進行一致性分析；Kappa值≥0.75說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好；0.4≤Kappa值＜0.75說明兩種方法診斷結(jié)果一致性一般；Kappa值＜0.4說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 個體化治療組患者Hp檢測結(jié)果分析 個體化治療組患者中男43 例，女 57 例，年齡 20～70（44.13±12.17）歲；胃鏡檢查及病理活檢結(jié)果顯示，個體化治療組均存在慢性胃炎，其中慢性活動性胃炎81例，伴慢性萎縮性胃炎30例，伴胃或十二指腸潰瘍20例；PCR-Sanger測序法檢測Hp的陽性率為80.00%（80/100），明顯高于細菌培養(yǎng)法的44.00%（44/100），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中慢性活動性胃炎患者的PCR-Sanger測序法與細菌培養(yǎng)法檢測Hp的陽性率均明顯高于慢性非活動性胃炎患者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而在慢性萎縮性胃炎與慢性非萎縮性胃炎、伴胃十二指腸潰瘍與不伴胃十二指腸潰瘍的患者之間兩種檢測方法的陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 個體化治療組Hp檢測結(jié)果分析（例）

另外，PCR-Sanger測序陽性80株菌株的耐藥基因測序結(jié)果分析顯示，克拉霉素耐藥31例，耐藥率38.75%（31/80），左氧氟沙星耐藥34例，耐藥率42.50%（34/80）；細菌培養(yǎng)陽性44株菌株的體外藥敏結(jié)果顯示，克拉霉素耐藥10例，耐藥率22.73%（10/44），左氧氟沙星耐藥12例，耐藥率27.27%（12/44）。細菌培養(yǎng)陽性44例中僅1例測序陰性，即兩種檢測方法均陽性43例。Kappa分析結(jié)果顯示，兩種檢測方法對克拉霉素及左氧氟沙星藥敏情況診斷的一致性分析Kappa值分別為0.532及0.641，提示兩種檢測方法診斷結(jié)果的一致性一般，見表3。

2.2 兩組患者Hp根除治療情況分析 個體化治療組PCR-Sanger測序陽性80例患者根據(jù)測序結(jié)果給予測序方案治療，測序陰性20例患者予經(jīng)驗方案治療，但不納入治療階段研究，而經(jīng)驗治療組100例患者均給予經(jīng)驗方案治療，故共180例患者納入治療階段研究。其中男 80 例，女 100 例，年齡 20～70（46.19±12.08）歲。個體化治療組共有9例患者被剔除或失訪，其中因服用克拉霉素后出現(xiàn)心悸1例，口服呋喃唑酮后出現(xiàn)皮疹或惡心無法繼續(xù)治療2例，治療不規(guī)范或失訪6例；經(jīng)驗治療組因治療不規(guī)范或失訪被剔除12例；兩組均有部分患者（個體化治療組12例，經(jīng)驗治療組18例）服用克拉霉素后出現(xiàn)口苦，但均未出現(xiàn)無法繼續(xù)治療的嚴重不良反應(yīng)。最終，按PP，個體化治療組Hp根除率90.14%（64/71）明顯高于經(jīng)驗治療組的77.27%（68/88），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；按ITT，個體化治療組Hp根除率80.00%（64/80）與經(jīng)驗治療組的 68.00%（68/100）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 4。

表3 Hp PCR-Sanger測序與藥敏試驗結(jié)果一致性分析（例）

表4 兩組患者Hp根除治療結(jié)果分析（例）

3 討論

現(xiàn)在普遍認為滿意的Hp根除治療方案的根除率應(yīng)達85%以上，且不引起嚴重的臨床不良反應(yīng)和細菌耐藥性。近年來，隨著Hp體外細菌培養(yǎng)及藥敏試驗在臨床上的廣泛開展，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇敏感抗生素進行個體化治療越來越受到重視。大量研究顯示，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果制定的Hp根除治療方案可顯著提高根除率[5-6]。然而，由于受到標本采集、保存、運送、分離培養(yǎng)等多方面因素的影響，目前Hp體外培養(yǎng)的陽性率并不高，有文獻報道醫(yī)院就診患者的培養(yǎng)陽性率僅為34.17%（17 731/51 891）[7]，明顯低于 Hp 平均感染率（約 50%）[8]。這部分培養(yǎng)陰性的Hp感染患者只能采用經(jīng)驗性方案進行根除治療，導致根除率降低或出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)，無法達到理想的治療效果。因此，想要提高這部分患者的Hp根除率，就需要一種靈敏度高且能檢測耐藥情況的檢測技術(shù)。

熒光PCR技術(shù)是一種直接檢測核酸的分子生物學技術(shù)，具有靈敏度、特異度高、操作簡單、能夠早期檢測病原體的優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于Hp的檢測[9]；PCRSanger測序法是目前應(yīng)用最多的核酸測序技術(shù)，具有高度的準確性，是基因檢測的金標準，目前已廣泛應(yīng)用于Hp的全基因組測序[10]。本研究結(jié)果顯示，PCR-Sanger測序法檢測Hp的陽性率為80.00%，仍有20.00%的假陰性率，考慮可能與PCR-Sanger測序法只取1塊胃黏膜組織進行基因提取與擴增有關(guān)，但其陽性率明顯高于細菌培養(yǎng)法的44.00%，提示PCR-Sanger測序法相對于細菌培養(yǎng)法能顯著提高Hp檢測的靈敏度，彌補細菌培養(yǎng)法靈敏度不高的缺點，使培養(yǎng)陰性的Hp感染患者也可以通過PCR-Sanger測序法分析選擇敏感抗生素進行個體化治療，從而提高Hp根除成功率。此外，目前臨床上應(yīng)用的細菌培養(yǎng)及藥敏試驗檢測的周期需要10 d，而PCR-Sanger測序法僅需3 d，可顯著提高檢測效率，從而提高患者的依從性，避免因檢測周期過長導致的患者失訪或治療不規(guī)范。

一項納入12篇RCT研究的薈萃分析結(jié)果表明[11]，含鉍劑經(jīng)驗四聯(lián)療法的根除率為77.6%，而含克拉霉素經(jīng)驗三聯(lián)療法的根除率僅為68.9%，均無法達到滿意的根除治療效果。目前Hp根除治療失敗的原因主要是由于Hp對常用的抗生素耐藥[12]。近些年報道推薦用于Hp根除治療的6種抗生素中，甲硝唑耐藥率達到40%～70%，克拉霉素達到20%～50%，左氧氟沙星達到20%～50%，而阿莫西林、呋喃唑酮和四環(huán)素的耐藥率仍很低（1%～5%）[4]。其中，甲硝唑因耐藥率太高，呋喃唑酮與四環(huán)素因藥物不良反應(yīng)及安全性問題，均已很少作為臨床一線使用；目前臨床上使用最多的抗生素是阿莫西林、克拉霉素及左氧氟沙星，因此Hp對左氧氟沙星與克拉霉素的耐藥情況與根除治療結(jié)果密切相關(guān)，如果能在治療前檢測出Hp對這兩種抗生素的耐藥情況，即可選擇敏感抗生素進行根除治療。

本研究通過PCR-Sanger測序法得出Hp對克拉霉素與左氧氟沙星的耐藥情況，從而制定個體化方案進行根除治療。結(jié)果顯示，個體化治療組Hp的根除率按PP達到90.14%（64/71），明顯高于經(jīng)驗治療組的77.27%（68/88），提示根據(jù)Sanger測序結(jié)果的個體化治療方案可顯著提高Hp的根除率；而個體化治療組與經(jīng)驗治療組的Hp根除率按ITT分別為80.00%（64/80）及68.00%（68/100），個體化治療組Hp根除率高于經(jīng)驗治療組，但兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義，分析原因可能與本研究的樣本量相對較少以及失訪率相對較高有關(guān)。同時，Kappa分析結(jié)果顯示，兩種檢測方法對克拉霉素及左氧氟沙星藥敏情況診斷結(jié)果的一致性一般，提示診斷Hp耐藥情況的基因型與表型之間可能還是存在一定的差異，也可能與本研究的樣本量相對不足有關(guān)，有待后續(xù)的大樣本研究加以證實。

綜上所述，PCR-Sanger測序法檢測Hp不僅靈敏度高，且檢測周期短、效率高，同時能分析Hp對克拉霉素與左氧氟沙星的耐藥情況，從而制定個體化治療方案，能顯著提高Hp根除率。