朱玲 強鑫華 嵇龍飛

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種廣泛分布在近海岸海水、海產(chǎn)品及腌制食品中的革蘭染色陰性嗜鹽桿菌，是引起食源性腹瀉的重要病原菌之一，是沿海城市食物中毒和夏秋季腹瀉疾病的主要病原菌［1］。有研究報道，由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的比例高達(dá)60%以上，居微生物性爆發(fā)病原的第一位［2］。自1996年首次爆發(fā)群體食物中毒事件以來［3］，VP的感染也升級為全球性公共衛(wèi)生問題。VP在臨床上主要是引起急性胃腸炎，另外還有傷口感染甚至菌血癥。VP的毒力機制復(fù)雜，目前大量研究表明，主要是由多種毒力基因編碼導(dǎo)致。另外，由于抗菌藥物的不合理使用，VP對常規(guī)抗菌藥的耐藥率也在逐年升高［4］。本資料對湖州哨點醫(yī)院腸道門診來源的VP進(jìn)行毒力基因（tdh、trh、tlh）檢測，O、K血清分型以及抗生素耐藥性試驗，以了解本地區(qū)VP的流行特征，為臨床和疾控防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株 收集2015年1月至2019年12月本院腸道門診就診的腹瀉患者，大便≥3次/d，糞便性狀異常（呈稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等），每人留取糞便標(biāo)本1份送本院微生物實驗室，培養(yǎng)所得VP用甘油肉湯凍存于本院微生物室-80℃冰箱，共計170株，備用。

1.2 方法 （1）菌種鑒定：致病菌的檢測方法菌株分離培養(yǎng)根據(jù)《浙江省食源性致病菌監(jiān)測工作手冊》進(jìn)行，細(xì)菌菌種鑒定采用梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定到種，儀器及配套試劑購自法國生物梅里埃公司。（2）毒力基因檢測：采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA：挑取火柴頭大小菌落溶于500μl滅菌水中，振蕩10s，100℃金屬浴10min，13,000r/min 4℃離心10min，上清液即為模板DNA。單重PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）進(jìn)行tdh、trh、tlh基因檢測。所有引物由上海生工股份有限公司合成，引物序列及大小見表1。反應(yīng)體系：25μl體系，其中引物（2對，濃度為10μmol/L）各 0.5μl，模板 DNA3μl，Taq 酶 12.5μl，用滅菌水補足至25μl。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min，94℃ 45s，55℃ 60s，72℃ 1min，30循環(huán)，72℃終延伸10min。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有對應(yīng)長度的擴(kuò)增條帶。（3）血清凝集：將收集的VP進(jìn)行O、K抗原的血清凝集，試劑購自日本株式會社，操作按照試劑說明進(jìn)行，有效期內(nèi)使用。（4）藥敏試驗：采用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)合美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會CLSI推薦，選取8類20種抗生素進(jìn)行藥敏試驗，以ATCC25922為質(zhì)控菌株，藥敏紙片購自英國OXOID公司，有效期內(nèi)使用，結(jié)果判讀依據(jù)CLSI M452017版藥敏準(zhǔn)則進(jìn)行。

表1 VP PCR檢測目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 一般數(shù)據(jù)結(jié)果 本資料所分離的170株VP中，2015年分離44株，2016年分離42株，2017年分離31株，2018年分離30株，2019年分離23株，其中男性來源70株，女性來源100株。

2.2 毒力基因檢測結(jié)果 170株VP均攜帶tlh基因，166株攜帶tdh基因，未檢測到攜帶trh基因。部分PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果見圖1、2。

圖1 部分菌株tdh基因PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果（DL 100 DNA Marker）

圖2 部分菌株tlh基因PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果（DL100 DNA Marker）

2.3 血清凝集 O血清凝集試驗，O3型最多，為121株（71.1%），其次為O4型，45株（26.5%）。K血清凝集試驗，K6型最多，79株（46.5%），部分菌株O、K不凝集，血清學(xué)結(jié)果以及毒力基因結(jié)果見表2。

表2 血清分型與毒力基因攜帶結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果 170株VP對AMP、KZ、PRL、AK、CN耐藥率較高，分別為100.00%、96.10%、75.00%、58.18%、32.73%，對C、LEV、AMC、SAM、CAZ、CTX、FOX敏 感 率 較 高， 分 別 為98.00%、95.06%、94.18%、94.18%、93.80%、93.80%、92.73%，所有菌株對TZP、FEP、IPM、MEM、CIP、SXT、TE均100.00%敏感。見表3。

表3 170株VP藥敏結(jié)果（%）

3 討論

VP的主要致病作用是其可產(chǎn)生溶血毒素，包括耐熱直接溶血素（thermostabledi rect hemoly sin，TDH）、耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素（TDH related hemolysin，TRH）和不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin，TLH），這三種溶血素分別由tdh、trh、tlh三種基因編碼［5］。其中TDH是致病性VP產(chǎn)生的不含糖或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)，可表現(xiàn)出溶血活性、細(xì)胞毒性、心臟毒性以及致死性等生物學(xué)活性［6］。研究表明［5］TDH是VP重要的致病因子，臨床分離株＞90%為TDH陽性株，而本資料發(fā)現(xiàn)，所有分離所得的170株VP攜帶率為97.6%（166/170），與其他地區(qū)檢測數(shù)據(jù)類似。TRH可引起細(xì)胞外Ca2+濃度的增加，從而導(dǎo)致Cl-分泌增多引起腹瀉，有研究表明，TRH與TDH氨基酸序列同源性高達(dá)67%。本研究收集所有VP，均未檢測到有trh基因的菌株，這點與國內(nèi)其他城市報道的情況有所區(qū)別［7-10］，具有湖州地區(qū)的特異性。TLH與TRH相反，在所有的VP中均有檢出，這與報道的文獻(xiàn)［5］一致，因為編碼TLH的tlh基因具有種屬特異性，不論菌株來自環(huán)境還是來自腹瀉患者，均攜帶該基因。除外上述三種毒力基因外，目前還有研究報道T3SS、T6SS分泌系統(tǒng)的基因［11］，這一部分，本地區(qū)菌株還有待進(jìn)一步研究。

VP血清型迄今為止有13個O抗原群和79個K抗原型組合而成的O∶K血清型，湖州地區(qū)以O(shè)3：K6型為最多，表明O3：K6是主要流行菌株。而且本地區(qū)所有的O3：K6菌株均攜帶tdh基因。本資料也發(fā)現(xiàn)，K血清型凝集結(jié)果不理想，大部分菌株存在凝集不出的情況，說明該菌血清型具有多樣性，接下去的研究可以試著用分子分型的方法來確定K血清型。

本研究參照CLSI-M45標(biāo)準(zhǔn)，選取了青霉素類、頭孢類、碳青霉烯類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、葉酸合成抑制劑八大類共20種抗菌藥物，對收集的170株VP進(jìn)行藥敏試驗。所得數(shù)據(jù)結(jié)果表明，湖州地區(qū)VP對抗生素的敏感性還比較高，大部分抗生素的敏感率＞90%，對TZP、FEP、IPM、MEM、CIP、SXT、TE未出現(xiàn)耐藥情況，對AMP、KZ的耐藥率較高，分析原因，可能與湖州水產(chǎn)養(yǎng)殖抗生素濫用有關(guān)，水產(chǎn)養(yǎng)殖戶為了保障產(chǎn)量，對水產(chǎn)進(jìn)行大量預(yù)防性用藥，而用的最多的就是青霉素類，因此，應(yīng)該加強對水產(chǎn)養(yǎng)殖抗生素的管理，以免造成VP耐藥率上升，出現(xiàn)耐藥菌株，給臨床治療帶來一定的難度。雖然本地區(qū)總體抗生素耐藥率不高，但也出現(xiàn)了對三類抗生素都耐藥的菌株，應(yīng)該引起重視，臨床治療時應(yīng)該合理選用抗生素，防止耐藥率的上升。