蔡夢穎,張平,宋煒涵,余江峰,郝棲賢,王平,劉世家,王益華,江玲*,萬建民,2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210095;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081)

隨著經(jīng)濟(jì)增長和消費(fèi)水平的提高,人們對優(yōu)質(zhì)稻米的需求越來越多[1]。稻米品質(zhì)指標(biāo)主要包括外觀品質(zhì)、食味品質(zhì)、營養(yǎng)成分和加工特性等。這些品質(zhì)性狀直接決定稻米的商品價(jià)值與營養(yǎng)價(jià)值以及消費(fèi)者的消費(fèi)行為[2]。對稻米食味品質(zhì)的評價(jià)大多基于淀粉的理化特性[3],如直鏈淀粉含量(amylose content,AC)、膠稠度(gel consistency,GC)、糊化溫度(gelatinization temperature,GT)與米飯的黏性、柔軟性、彈性等關(guān)系密切,是間接評價(jià)稻米蒸煮食味品質(zhì)的重要參數(shù)[4]。其中,直鏈淀粉含量與稻米蒸煮食味品質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān),而膠稠度與蒸煮食味品質(zhì)呈顯著正相關(guān)。另外,稻米淀粉黏滯性譜(RVA譜)可以快速鑒定稻米蒸煮食味品質(zhì)指標(biāo),其特征值熱漿黏度、冷膠黏度、消減值、峰值時(shí)間、起漿溫度與食味品質(zhì)相關(guān)性狀(如柔軟性、彈性、冷飯質(zhì)地等)呈極顯著負(fù)相關(guān),而特征值崩解值與其呈極顯著正相關(guān)[5]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉除包括真正的直鏈淀粉外,還包括支鏈淀粉中的中長鏈淀粉,因此,支鏈淀粉是造成直鏈淀粉含量相同或相近的水稻品種間食味品質(zhì)差異的重要原因[6]。越來越多的學(xué)者開始關(guān)注支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)以及支鏈的組成、長度、聚合度與稻米理化特性和食味品質(zhì)間的關(guān)系。

淀粉是稻米胚乳中主要的儲存成分,包括直鏈淀粉和支鏈淀粉,其組成和結(jié)構(gòu)對稻米的食味品質(zhì)起決定性影響[7]。直鏈淀粉含量作為稻米品質(zhì)的重要評價(jià)指標(biāo),對稻米品質(zhì)的影響最大。已有研究表明,由水稻蠟質(zhì)基因(Waxy,Wx)編碼的顆粒淀粉合酶(granule bound starch synthaseⅠ,GBSSⅠ)負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成,主要包括Wxa和Wxb這2種類型,其中攜帶Wxa的秈稻直鏈淀粉含量一般較高,Wxb主要分布在粳稻品種中,攜帶Wxb的品種直鏈淀粉含量為中等至較低水平[8]。可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase,SSS)也是催化淀粉合成的一個(gè)關(guān)鍵酶,主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成。水稻中已發(fā)現(xiàn)8個(gè)SSS[9],分別是SSSⅠ、SSSⅡa、SSSⅡb、SSSⅡc、SSSⅢa、SSSⅢb、SSSⅣa和SSSⅣb,編碼這些酶的基因都可能參與淀粉品質(zhì)形成過程。Tian等[3]研究發(fā)現(xiàn),Wx和SSSⅡa通過影響3個(gè)品質(zhì)性狀(直鏈淀粉含量、膠稠度和糊化溫度)來決定稻米的蒸煮食味品質(zhì),另外還有12個(gè)淀粉合成相關(guān)基因參與調(diào)控。表明Wx基因效應(yīng)顯著,而其他淀粉合成相關(guān)基因也發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用。

Jiang等[10]研究發(fā)現(xiàn)3種編碼SSSⅡ基因,分別為SSSⅡa、SSSⅡb和SSSⅡc。SSSⅡa主要在胚乳表達(dá),SSSⅡb主要在葉片表達(dá),SSSⅡc在胚乳、葉片和根中均有表達(dá)[11]。Hirose等[12]研究表明SSSⅡb基因負(fù)責(zé)合成中等長度鏈的支鏈淀粉。淀粉的結(jié)構(gòu)決定其功能特性,淀粉的晶體層主要由支鏈淀粉高度分支的雙螺旋結(jié)構(gòu)組成,較大比例的中等或長支鏈分支淀粉會(huì)穩(wěn)定晶體層的熱糊化特性,使稻米糊化溫度升高,而短支鏈分支淀粉的比例與淀粉糊化溫度負(fù)相關(guān),優(yōu)質(zhì)稻米品種往往具有較低的糊化溫度。SSSⅡb基因主要負(fù)責(zé)合成支鏈淀粉的中等長度鏈[13],因此,敲除該基因能夠減少中等鏈長淀粉的比例,產(chǎn)生較多的短鏈分支淀粉,從而使稻米具有較低的糊化溫度和較優(yōu)的品質(zhì)特性。

‘寧粳4號’屬粳型常規(guī)水稻,直鏈淀粉含量在16%～17%,為進(jìn)一步降低該品種直鏈淀粉含量,增加適口性,Sun等[14]利用近幾年發(fā)展起來的基因組編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9,以‘寧粳4號’為受體,以淀粉合酶基因SSSⅡb(Os02g0744700)為目標(biāo)基因,創(chuàng)制了一批淀粉合酶基因SSSⅡb敲除的轉(zhuǎn)基因家系。本研究經(jīng)過分子鑒定,選出已敲除目標(biāo)基因、不含Cas9載體構(gòu)建的SSS2-Q家系,其直鏈淀粉含量較‘寧粳4號’下降,并對該家系進(jìn)行生理生化特征及農(nóng)藝性狀的考察,評價(jià)其利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SSSⅡb基因位于第2染色體,大小為4 919 bp。本研究在該基因的前、中、后設(shè)置3個(gè)靶點(diǎn),分別構(gòu)建基于CRISPR/Cas9的敲除載體,以‘寧粳4號’為受體,進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

‘寧粳4號’基因編輯后的T0代轉(zhuǎn)基因苗,種子量少,進(jìn)一步繁種得T1代。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)T1代植株發(fā)生堿基變化的位點(diǎn)部分為雜合型,繼續(xù)繁種得T2代。挑選T2代純合敲除的植株加代種植,獲得T3代穩(wěn)定的、純合敲除的轉(zhuǎn)基因家系。根據(jù)編輯靶點(diǎn)位置的不同,分別命名為SSS2-Q、SSS2-Z、SSS2-H(圖1)。

圖1 SSSⅡb基因的靶點(diǎn)位置Fig.1 The location of SSSⅡb gene target sites

1.2 材料種植和取樣調(diào)查

將T3代SSS2-Q、SSS2-Z、SSS2-H轉(zhuǎn)基因家系和‘寧粳4號’種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋水稻試驗(yàn)站。行距為20 cm,株距為13.3 cm,每穴1苗,每行10株,3個(gè)轉(zhuǎn)基因家系各6行,常規(guī)大田管理。抽穗前,分單株取‘寧粳4號’和轉(zhuǎn)基因家系葉片用于DNA的提取。水稻開花時(shí),對當(dāng)天開花的‘寧粳4號’和轉(zhuǎn)基因家系進(jìn)行點(diǎn)穎標(biāo)記,在開花12 d后取各個(gè)家系的胚乳,用于RNA提取。水稻成熟后,根據(jù)分子鑒定結(jié)果隨機(jī)選取‘寧粳4號’和各個(gè)轉(zhuǎn)基因家系20株陽性單株,調(diào)查株高、分蘗數(shù)、一次枝梗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率等。收取‘寧粳4號’和各個(gè)轉(zhuǎn)基因家系陽性單株,烘干至恒重,用萬深SC-G自動(dòng)考種儀測量粒長、粒寬、千粒重,3次重復(fù)。用于后續(xù)品質(zhì)指標(biāo)測定。

1.3 分子標(biāo)記鑒定

1.3.1 DNA提取采用CTAB法提取DNA,步驟如下:剪葉片放入2.0 mL EP管中,球磨儀粉碎后,加入600 μL CTAB提取液,65 ℃水浴30 min。加入600 μL氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶1),12 000 r·min-1離心5 min,吸400 μL上清液于另一新的1.5 mL EP管,加入240 μL異丙醇溶液,冷凍30 min。4 ℃ 12 000 r·min-1離心3 min,棄上清液,加入400 μL 70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液洗滌后棄乙醇,晾干。加入200 μL ddH2O溶解,即得DNA母液。

1.3.2 PCR反應(yīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:DNA模板2.0 μL,10 μmol·L-1正、反向引物各1.0 μL,10× Buffer(Mg2+plus)2.0 μL,2.5 mmol·L-1dNTP1.0 μL,rTaqDNA聚合酶(TaKaRa)0.1 μL,加ddH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,36個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃ 10 min。將得到的PCR產(chǎn)物于4 ℃保存,PCR擴(kuò)增引物見表1。

表1 鑒定轉(zhuǎn)基因家系的PCR引物Table 1 Primers of the transgenic lines used for PCR reaction

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳用450 mmol·L-1Tris-H3BO3和10 mmol·L-1EDTA調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0;配制50× TAE緩沖液母液,將母液稀釋為1× TAE的緩沖液作為電泳液,用其配制10 g·L-1瓊脂糖凝膠,加1滴溴化乙錠,待冷卻凝固后點(diǎn)樣(加Loading Buffer的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。在電壓150 V、電流80 mA條件下電泳15 min后取出,在凝膠成像儀下觀察,切目標(biāo)條帶,送南京擎科生物科技有限公司測序,鑒定敲除效應(yīng)。

1.4 品質(zhì)指標(biāo)的測定

1.4.1 直鏈淀粉含量測定在已調(diào)查農(nóng)藝性狀的各個(gè)轉(zhuǎn)基因家系20個(gè)單株中隨機(jī)挑選10個(gè)單株和‘寧粳4號’的種子,去殼得糙米,將糙米研磨成精米,再磨碎成過147 μm篩孔的精米粉,對其精米粉進(jìn)行直鏈淀粉含量測定。參照《水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測定法:GB 7648—1987》進(jìn)行測定:稱取精米粉 0.100 0 g,置于100 mL容量瓶,加入95%乙醇1 mL和1 mol·L-1NaOH 溶液9 mL,沸水浴10 min,冷卻,定容。取5 mL定容后的溶液至新的容量瓶中,加入1 mol·L-1乙酸1 mL和1.5 mL碘液,定容,靜置20 min。使用分光光度計(jì)在620 nm波長下測定樣品的吸光度值,計(jì)算出待測樣品的直鏈淀粉含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.4.2 支鏈淀粉鏈長分布檢測在已完成直鏈淀粉含量測定的‘寧粳4號’與轉(zhuǎn)基因家系的10個(gè)單株中,選取直鏈淀粉含量下降顯著單株的精米粉進(jìn)行支鏈淀粉鏈長的測定。稱取5 mg精米粉于2.0 mL EP管中,采用Han等[15]的方法進(jìn)行處理。加入20 μL ddH2O對樣品稀釋、過濾,37 ℃保溫?cái)?shù)分鐘,離心,水洗2次。樣品經(jīng)凍干機(jī)干燥成干粉狀,加入3 mol·L-1尿素80 μL,用于毛細(xì)管電泳。在ABI3730XL高通量DNA測序儀上進(jìn)行電泳分析,電泳完畢,導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

1.4.3 膠稠度測定在已完成直鏈淀粉含量測定的‘寧粳4號’與轉(zhuǎn)基因家系的10個(gè)單株中,選取直鏈淀粉含量變化的單株精米粉進(jìn)行膠稠度測定。稱取精米粉100 mg放入玻璃試管,加入95%乙醇麝香草酚藍(lán)液200 μL和0.2 mol·L-1的KOH溶液2 mL;沸水中加熱8 min,取出試管置于室溫10 min,冰水浴 20 min;再把試管水平放在鋪有方格坐標(biāo)紙的水平臺上,靜置1 h。記錄米膠流淌長度,以mm為單位表示。

1.4.4 米粉黏度的測定用于米粉黏度測定的單株同1.4.3節(jié),稱取精米粉3.0 g于鋁杯中,加入25.0 mL ddH2O攪拌。采用瑞典波通公司的快速黏度分析儀(RVA)測定米粉的黏度特性,儀器在水循環(huán)下使用,具體測定參照隋炯明等[5]的方法。

1.5 RNA提取及RT-qPCR

使用RNApure Plant Kit(Tiangen)提取‘寧粳4號’和轉(zhuǎn)基因家系總RNA。將開花12 d后的胚乳于冰上研磨,具體步驟參見試劑盒。向模板RNA(1 μg)中加入1 μL Oligo dT Primer、1 μL dNTP Mixture,用RNA Free ddH2O補(bǔ)充至10 μL。65 ℃保溫5 min后,冰上迅速冷卻。在上述10 μL 反應(yīng)液中加入4 μL 5×PrimeScriptⅡ Buffer、0.5 μL RNase Inhibitor、0.5 μL PrimeScriptⅡ RTase,用RNA Free ddH2O補(bǔ)充至 20 μL。經(jīng)42 ℃ 1 h,72 ℃ 15 min,4 ℃ 10 min合成cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系:8 μL cDNA模板(稀釋10倍使用)、1.6 μL引物、10.4 μL SYBR Green熒光染料。以水稻Ubq基因作為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)3個(gè)重復(fù)。RT-qPCR反應(yīng)在ABI PRISM 7500HT儀器上進(jìn)行,采用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因家系的分子鑒定

對SSSⅡb基因進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯,得到3個(gè)獨(dú)立來源的轉(zhuǎn)基因家系SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H(圖2)。SSS2-Q家系在靶點(diǎn)處產(chǎn)生4種類型的突變:缺少3個(gè)堿基(-3TAA)、缺少2個(gè)堿基(-2TA)、缺少11個(gè)堿基、插入1個(gè)堿基(+C)。SSS2-Z家系在靶點(diǎn)處產(chǎn)生2種類型的突變:插入1個(gè)堿基(+T)、缺少1個(gè)堿基(-T)。SSS2-H家系在靶點(diǎn)處產(chǎn)生2種類型的突變:插入1個(gè)堿基(+T)、缺少1個(gè)堿基(-T)。選擇基因型、表型穩(wěn)定且株型未發(fā)生顯著變化的轉(zhuǎn)基因家系,用于后續(xù)研究。

圖2 靶向編輯SSSⅡb基因位點(diǎn)示意圖Fig.2 Schematic diagram of the targeted site in the SSSⅡb gene箭頭表示起始密碼子和終止密碼子,括號中的數(shù)字表示到起始密碼子(ATG)的距離。黑盒子表示編碼序列,白盒子表示未翻譯區(qū)域。Arrows indicate the start codon and stop codon. The numbers in brackets indicate the distance to the start codon(ATG). Black box denotes coding sequence,and white box is the untranslated region.

這些家系在SSSⅡb基因序列上分別發(fā)生以下變化:SSS2-Q家系的編輯位點(diǎn)發(fā)生在5′非翻譯區(qū),該靶點(diǎn)處發(fā)生1個(gè)堿基(+C)的插入,不影響翻譯和氨基酸序列,但影響SSSⅡb基因的表達(dá);SSS2-Z家系在靶點(diǎn)處發(fā)生1個(gè)堿基(+T)的插入,導(dǎo)致SSSⅡb氨基酸序列提前終止;SSS2-H家系在靶點(diǎn)處發(fā)生1個(gè)堿基(+T)的插入,使末尾幾個(gè)氨基酸序列發(fā)生替換。

為挑選出轉(zhuǎn)基因家系中含目標(biāo)片段但不含Cas9載體構(gòu)建的單株,對每個(gè)家系各世代的單株進(jìn)行分子檢測,結(jié)果見表2。從每個(gè)世代中選擇陽性單株,然后再從陽性單株中挑選不含Cas9載體構(gòu)建的單株。

表2 不同轉(zhuǎn)基因家系分子檢測情況Table 2 Molecular identification of different transgenic lines

如圖3所示:SSS2-Q-1—SSS2-Q-10、SSS2-Z-1—SSS2-Z-10、SSS2-H-1—SSS2-H-10分別為SSS2-Q、SSS2-Z、SSS2-H家系T3代10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因單株,選用這些單株進(jìn)行分子鑒定。SSS2-Q家系10個(gè)單株含有目標(biāo)片段但不含有Cas9載體構(gòu)建,SSS2-Z-6、SSS2-Z-10和SSS2-H-4、SSS2-H-9、SSS2-H-10含有目標(biāo)片段且含有Cas9載體構(gòu)建。

圖3 SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系T3代轉(zhuǎn)基因單株的基因型鑒定Fig.3 Genotype identification of T3 transgenic plants of SSS2-Q,SSS2-Z and SSS2-H linesA、B、C. SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系目標(biāo)片段鑒定;D、E、F. SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系Cas9鑒定。M. 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);+. 陽性對照;-. 陰性對照;1～10分別為SSS2-Q、SSS2-Z、SSS2-H家系T3代10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因單株。下同。A,B,C. Identification of target fragments in SSS2-Q,SSS2-Z and SSS2-H lines;D,E,F. Identification of Cas9 in SSS2-Q,SSS2-Z and SSS2-H lines. M. Molecular weight marker;+. Positive control;-. Negative control;1-10 represent 10 independent T3 transgenic plants of SSS2-Q,SSS2-Z and SSS2-H lines,respectively. The same as follows.

2.2 T3代各家系直鏈淀粉含量變化

對‘寧粳4號’和T3代各個(gè)家系10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因單株進(jìn)行直鏈淀粉含量測定。結(jié)果(表3)顯示:SSS2-Q家系較‘寧粳4號’直鏈淀粉含量顯著下降,SSS2-Z家系直鏈淀粉含量與‘寧粳4號’沒有顯著差異,SSS2-H家系與‘寧粳4號’相比直鏈淀粉含量升高。對SSSⅡb基因設(shè)計(jì)多靶點(diǎn)敲除,僅SSS2-Q家系符合低直鏈淀粉水稻品種選育的目標(biāo)。

表3 ‘寧粳4號’和SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系T3代10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因單株的直鏈淀粉含量Table 3 Amylose content of ‘Ningjing 4’and 10 independent T3 transgenic plants of SSS2-Q,SSS2-Z and SSS2-H lines

2.3 SSS2-Q家系支鏈淀粉鏈長分布

與‘寧粳4號’相比,SSS2-Q家系(SSS2-Q-3)支鏈淀粉鏈長聚合度(degree of polymerization,DP)分布在10

圖4 ‘寧粳4號’與SSS2-Q家系淀粉支鏈長分布的差異Fig.4 Difference in amylopectin chain length distributions between‘Ningjing 4’and SSS2-Q lines

2.4 轉(zhuǎn)基因家系膠稠度和快速黏度(RVA譜)分析

‘寧粳4號’膠稠度平均為86 mm。SSS2-Q家系(SSS2-Q-3和SSS2-Q-5)膠稠度與‘寧粳4號’相比顯著升高;而SSS2-Z家系(SSS2-Z-4和SSS2-Z-8)膠稠度與‘寧粳4號’沒有差異;SSS2-H家系(SSS2-H-3和SSS2-H-6)膠稠度與‘寧粳4號’相比有所下降(圖5)。由于膠稠度與蒸煮食味品質(zhì)呈顯著正相關(guān)關(guān)系,表明SSS2-Q家系食味品質(zhì)優(yōu)于‘寧粳4號’和其他2個(gè)家系。

圖5 ‘寧粳4號’與3個(gè)轉(zhuǎn)基因家系的膠稠度Fig.5 Gel consistency of ‘Ningjing 4’and three different knockout transgenic lines

從表4可見:SSS2-Q家系(SSS2-Q-3)的淀粉熱漿黏度、冷漿黏度、峰值時(shí)間、起漿溫度均低于‘寧粳 4號’,崩解值高于‘寧粳4號’。SSS2-Z家系(SSS2-Z-4)、SSS2-H家系(SSS2-H-3)的熱漿黏度、冷漿黏度低于‘寧粳4號’但高于SSS2-Q家系,崩解值高于‘寧粳4號’但低于SSS2-Q家系。SSS2-Q家系的淀粉黏滯性特征值均較好。

表4 ‘寧粳4號’與3個(gè)轉(zhuǎn)基因家系單株的淀粉快速黏度分析Table 4 Rapid viscosity analysis of ‘Ningjing 4’and three different knockout transgenic lines

2.5 SSS2-Q家系胚乳中淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)水平變化

從圖6可見:SSS2-Q家系(SSS2-Q-3)中SSSⅡb基因表達(dá)水平極顯著低于‘寧粳4號’,SSS2-Q家系(SSS2-Q-3)其他淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)水平也發(fā)生變化,如:SSSⅢa、SBEⅡa(淀粉分支酶Ⅱa Starch branching enzyme Ⅱa)基因表達(dá)量升高,SSSⅠ、SSSⅡa和SBEⅡb基因表達(dá)水平下降,而顆粒結(jié)合淀粉合成酶(granule-bound starch synthase,GBSS)表達(dá)沒有變化。SSS2-Q家系SSSⅡb基因在5′非翻譯區(qū)發(fā)生堿基變化,該區(qū)域可能存在控制基因表達(dá)的調(diào)控序列,基因編輯之后導(dǎo)致SSSⅡb基因的表達(dá)水平發(fā)生變化,同時(shí)引起其他淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)紊亂和補(bǔ)償,進(jìn)而影響淀粉合成途徑和理化性質(zhì)。

圖6 ‘寧粳4號’與SSS2-Q家系胚乳中淀粉合成相關(guān)基因的相對表達(dá)水平Fig.6 Relative expression level of starch synthesis related genes in‘Ningjing 4’and SSS2-Q transgenic lines

2.6 SSS2-Q家系農(nóng)藝性狀

‘寧粳4號’與SSS2-Q家系(SSS2-Q-5)成熟期植株表型如圖7所示?？挤N發(fā)現(xiàn),SSS2-Q家系每穗粒數(shù)與‘寧粳4號’沒有差異,每穗實(shí)粒數(shù)顯著下降,結(jié)實(shí)率降低,出現(xiàn)一些空殼、癟粒,可能是由于轉(zhuǎn)基因影響育性相關(guān)的性狀。另外SSS2-Q家系稻粒變長,其他農(nóng)藝性狀沒有顯著變化(表5)。

圖7 ‘寧粳4號’與SSS2-Q家系植株表型Fig.7 The plant phenotype of ‘Ningjing 4’and SSS2-Q transgenic linesA和B分別代表‘寧粳4號’與SSS2-Q家系成熟期植株表型,標(biāo)尺為18 cm。A and B represent the plants of ‘Ningjing 4’and SSS2-Q transgenic lines after maturation,respectively. Bar=18 cm.

表5 2019年‘寧粳4號’與SSS2-Q家系農(nóng)藝性狀表現(xiàn)Table 5 Agronomic traits of ‘Ningjing 4’and SSS2-Qtransgenic lines in 2019

3 討論

稻米的主要組分是淀粉,包括直鏈淀粉和支鏈淀粉,2種類型淀粉的比例、組成及其精細(xì)結(jié)構(gòu)差異是影響稻米食味品質(zhì)的主要決定因素[13]。直鏈淀粉含量作為稻米品質(zhì)的重要評價(jià)指標(biāo),由GBSSⅠ控制直鏈淀粉合成,對稻米品質(zhì)的影響較大,另外還存在其他淀粉合酶基因共同調(diào)控水稻品質(zhì)特性。SSS各類同工型在支鏈淀粉合成中發(fā)揮不同作用,并具有特定的功能[16]。Jeon等[9]報(bào)道,SSSⅠ主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉短鏈合成,其秈型等位基因編碼的酶活性更強(qiáng),能提高稻米淀粉的黏滯性。SSSⅣ的2種同工型(SSSⅣa和SSSⅣb)在擬南芥中過表達(dá)后能夠提高葉片瞬時(shí)淀粉的含量,其可能在水稻中具有增加淀粉含量的潛能[17]。Zhu等[18]通過同時(shí)下調(diào)SBEⅠ和SBEⅡb的表達(dá)而獲得直鏈淀粉含量接近50%、抗性淀粉含量達(dá)到13%左右的轉(zhuǎn)基因水稻材料。Li等[13]利用RNA干擾技術(shù)抑制SSSⅡb基因的表達(dá)培育出軟米品種。上述研究表明,通過合理的基因選擇,進(jìn)行不同等位組合可以達(dá)到改良品質(zhì)的目的,培育出優(yōu)質(zhì)的稻米種質(zhì)資源。

直鏈淀粉含量與稻米食味品質(zhì)負(fù)相關(guān),直鏈淀粉含量高的米煮飯時(shí)膨脹性較大,米飯松散,冷后發(fā)硬,適口性較差;而直鏈淀粉含量較低的米煮飯時(shí)膨脹性較小,米飯蓬松柔軟,深受人們青睞?！畬幘?號’的直鏈淀粉含量在16%左右,在此基礎(chǔ)上適度降低含量,能夠綜合軟米的柔軟性和粳稻的彈性,使其適口度增加,更被人們所接受。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),以水稻品種‘寧粳4號’為受體,對SSSⅡb基因進(jìn)行多靶點(diǎn)敲除,即在該基因的前、中、后位置設(shè)計(jì)敲除位點(diǎn),通過基因型和表型鑒定,獲得了目標(biāo)基因受到編輯、不含Cas9載體構(gòu)建的SSS2-Q家系。與前人采用RNA干擾技術(shù)[13]下調(diào)SSSⅡb基因表達(dá)的研究相比,SSS2-Q家系在表型得到改善的同時(shí),也實(shí)現(xiàn)了剔除轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建的目標(biāo)。該家系基因編輯部位發(fā)生在5′非翻譯區(qū),抑制了SSSⅡb基因表達(dá),但沒有影響基因的完整結(jié)構(gòu),酶蛋白功能應(yīng)該是正常的。SSS2-Q家系直鏈淀粉含量較‘寧粳4號’顯著降低,膠稠度、RVA特征值等指標(biāo)得到優(yōu)化,植株外觀沒有顯著變化。同時(shí)SSS2-Q家系米粉支鏈淀粉鏈長精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,中等長度鏈比例降低,RVA譜測定的淀粉成糊溫度即起漿溫度降低。研究表明中等長度鏈減少之后對稻米外觀沒有影響,但能夠降低稻米的糊化溫度,進(jìn)而具有較好的食味表現(xiàn)[2],說明SSS2-Q家系食味品質(zhì)特性得到改良。進(jìn)一步 RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn),在SSS2-Q家系中SSSⅡb基因表達(dá)下調(diào),其他淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了變化,如SSSⅢa基因表達(dá)升高,該基因突變后淀粉黏滯性降低[2],猜測可能是SSS2-Q家系淀粉黏滯性改變的原因;SBEⅡa基因表達(dá)升高,該基因影響支鏈淀粉短鏈的形成。SSSⅠ、SSSⅡa和SBEⅡb表達(dá)水平下降,SSSⅠ是胚乳中主要的淀粉合酶基因,SSSⅡa基因能夠合成支鏈淀粉中的長鏈,影響淀粉的理化性質(zhì),SBEⅡb在支鏈淀粉形成中也起到重要的作用。淀粉的生物合成受20多種酶的調(diào)控,其表達(dá)調(diào)控極為復(fù)雜,仍需進(jìn)一步研究。

水稻籽粒灌漿過程中,可溶性淀粉合酶之間通過形成酶蛋白復(fù)合體行使功能,當(dāng)某種特定酶的活性改變時(shí),淀粉合成酶蛋白復(fù)合物的組成將有所改變。例如,粳稻SSSⅡa的活性僅是秈稻中的10%,粳稻中SSSⅡa與其他淀粉合成酶的相互作用削弱,但在胚乳發(fā)育時(shí)期SSSⅡa可通過與SSSⅠ、SBEⅡb或其他淀粉合成酶形成蛋白復(fù)合體的形式,確保淀粉的正常產(chǎn)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn),SSS2-Q家系灌漿時(shí)期SSSⅡb基因表達(dá)受阻,淀粉積累緩慢,但后期可以形成正常透明的水稻種子。SSS2-Z家系SSSⅡb氨基酸序列提前終止,該酶不能行使正常功能,推測SSSⅡb可與其他淀粉合成酶形成替代復(fù)合體的形式,保證淀粉顆粒形態(tài)、分子大小、直鏈淀粉含量不受影響。SSS2-H家系僅是末尾幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換,就能影響其酶活,進(jìn)而影響支鏈淀粉的合成,導(dǎo)致直鏈淀粉含量有所升高。SSS2-Z和SSS2-H家系沒有達(dá)到品質(zhì)改良的預(yù)期目標(biāo),考慮到本研究選育的SSS2-Q家系,農(nóng)藝性狀還不夠理想,影響育種利用,尚需進(jìn)一步研究和改良。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可加速對優(yōu)異基因的利用,本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向編輯淀粉合酶基因SSSⅡb,調(diào)控淀粉生物合成途徑,降低了受體品種‘寧粳4號’的直鏈淀粉含量,獲得符合預(yù)期目標(biāo)的SSS2-Q家系,實(shí)現(xiàn)改良稻米品質(zhì)的目標(biāo),同時(shí)該家系不含有轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建,可作為新種質(zhì),以培育優(yōu)質(zhì)稻米新品種。

致謝:農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心、南方粳稻研究開發(fā)有限公司給予支持,謹(jǐn)致謝意。