高潤紅,郭桂梅,何婷,杜志釗,任金寶,劉成洪,陸瑞菊*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海 201106;2.上海市農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心,上海 200335;3.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 蘇州 215008)

加倍單倍體(doubled haploid,DH)技術(shù)是實現(xiàn)純合最快的方法,已應(yīng)用在植物育種等研究中[1]。小孢子培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)是常用的獲取單倍體的方法。相對于花藥培養(yǎng),小孢子培養(yǎng)更有優(yōu)勢,去除花藥壁的影響,直接對小孢子進(jìn)行操作,短時間內(nèi)可以處理更大的群體,從而增加綠苗產(chǎn)量,節(jié)省大量資源[2]。在大麥中,通過小孢子培養(yǎng)來產(chǎn)生DH群體是最有效的方法[3]。影響小孢子培養(yǎng)效果的因素很多,包括基因型、供體植株的生長條件、小孢子的發(fā)育時期、培養(yǎng)前預(yù)處理和培養(yǎng)基成分等[4-6]。其中小孢子適宜的發(fā)育時期是單核中晚期,這一時期的小孢子經(jīng)過逆境處理后去分化,獲得細(xì)胞全能性,然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下分裂發(fā)育成胚性愈傷組織,最后形成植株[7]。小孢子的發(fā)育階段可以通過細(xì)胞學(xué)觀察來確定,這對于大批量的試驗而言費時費力[8]。因此尋找合適的形態(tài)學(xué)指標(biāo)來評判小孢子的發(fā)育時期非常必要。

旗葉距是指旗葉與倒二葉的葉耳間距離,可以作為大麥和小麥減數(shù)分裂、幼穗大小的一個形態(tài)學(xué)指標(biāo)[9-10]。有研究表明,在大麥中不同旗葉距對每穗分離的小孢子產(chǎn)量有非常顯著的影響,最佳的收獲時期能夠?qū)⑴咝孕℃咦拥漠a(chǎn)量提高2～4倍[3]。在燕麥中,旗葉距對花藥愈傷產(chǎn)量和綠苗再生具有顯著的影響[11]。

本實驗室已經(jīng)建立了大麥小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系,在田間取材過程中發(fā)現(xiàn)旗葉距的大小跨度很大,同一批材料的小孢子培養(yǎng)效果存在較大的差異。因此我們對同一天取材的穗子根據(jù)旗葉距的長度進(jìn)行分組,研究不同旗葉距對大麥小孢子愈傷組織誘導(dǎo)和綠苗再生的影響,為大麥小孢子培養(yǎng)提供更為精細(xì)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為大麥(HordeumvulgareL.)品種‘花30’,2017—2018年種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院青浦試驗基地,正常水肥管理。2018年3月24日選取旗葉距0.5～7.0 cm的幼穗,測量旗葉距并按長度分為6組,分別是0.5～2.0 cm、2.1～3.0 cm、3.1～4.0 cm、4.1～5.0 cm、5.1～6.0 cm和6.1～7.0 cm。剪去葉片,包裹保鮮袋放入4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理17 d,每組取15個左右的幼穗。

1.2 小孢子DAPI染色

取不同旗葉距幼穗的中部3枚花藥放入卡諾氏固定液(無水乙醇和冰乙酸的體積比為3∶1)固定10 min,取出清洗干凈置于載玻片上,加20 μL ddH2O,用鑷子將花藥夾破使小孢子游離出來,取10 μL小孢子懸浮液并加入0.1 mg·mL-14′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液10 μL,混合均勻,常溫黑暗放置 10 min,熒光顯微鏡下觀察。于低溫處理前、后的每個分段分別觀察5個視野,并統(tǒng)計每個視野下單核小孢子所占的比例。

1.3 小孢子培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)以及綠苗分化

參照郭桂梅等[12]方法將低溫預(yù)處理后不同旗葉距的幼穗進(jìn)行消毒滅菌;小孢子游離參照Lu等[13]方法。收集的小孢子置于提取液中,25 ℃、黑暗預(yù)處理2 d后,用210 g·L-1麥芽糖純化,純化后的小孢子用誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌1次,密度調(diào)節(jié)至1.0×105mL-1,取1 mL小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿(30 mm×15 mm)中,用Parafilm封口。每組5個重復(fù),25 ℃、黑暗培養(yǎng)18 d后,吸干誘導(dǎo)培養(yǎng)基,稱取愈傷組織質(zhì)量,然后將愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基,25 ℃、12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng),待再生苗長至3 cm左右統(tǒng)計綠苗數(shù),并將綠苗移入壯苗生根培養(yǎng)基。小孢子提取液、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、壯苗生根培養(yǎng)基成分參照文獻(xiàn)[14]。提取液和誘導(dǎo)培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾滅菌,分化和壯苗生根培養(yǎng)基經(jīng)0.11 MPa、121 ℃高溫高壓滅菌15 min。

1.4 小孢子再生植株倍性鑒定

將已生根的再生植株從壯苗培養(yǎng)基中取出,洗凈基部培養(yǎng)基后,用海綿條包裹,放入Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)3周,取第1片完全展開葉中部2～3 cm和新生根尖1.5 cm,分別進(jìn)行氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長度測定和根尖染色體制片。氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長度測定參考何婷等[15]方法;根尖染色體制片參考Chen等[16]方法。

1.5 指標(biāo)測定及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

愈傷組織產(chǎn)量:每皿小孢子培養(yǎng)18 d時產(chǎn)生的愈傷組織量(mg);再生能力:每100 mg愈傷組織分化出的綠苗數(shù)。

所有試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007和DPS 7.05進(jìn)行整理、統(tǒng)計分析及差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同旗葉距小孢子發(fā)育時期的顯微觀察

利用DAPI染色對不同旗葉距小孢子發(fā)育時期進(jìn)行鑒定。顯微觀察(圖1)顯示:在取材當(dāng)天(定義為0 d)6個旗葉距游離的小孢子均處于單核期;隨著旗葉距的增大,小孢子的核呈現(xiàn)出從致密到松散的變化趨勢。經(jīng)過4 ℃低溫處理17 d后(圖2),不同旗葉距小孢子的時期發(fā)生了明顯的變化,從單核期發(fā)展到單核與二核混合期。在0.5～2.0 cm旗葉距中,單核占據(jù)相對較大的比例,而且單核和二核在DAPI染色下均有比較明顯的熒光;隨著旗葉距的增加,特別是旗葉距為6.1～7.0 cm時,游離小孢子基本以二核形態(tài)存在,而且2個核DAPI染色熒光較弱,核質(zhì)呈現(xiàn)松散狀態(tài)。

圖1 取材0 d時不同旗葉距小孢子發(fā)育時期的細(xì)胞學(xué)觀察Fig.1 Cytological observation of microspore development at different space of flag leaf on the day of samplingA. 0.5～2.0 cm;B. 2.1～3.0 cm;C. 3.1～4.0 cm;D. 4.1～5.0 cm;E. 5.1～6.0 cm;F. 6.1～7.0 cm. Bar=100 μm.

圖2 低溫處理17 d后不同旗葉距小孢子發(fā)育時期的細(xì)胞學(xué)觀察Fig.2 Cytological observation of microspore development at different space of flag leaf after 17 days of low temperature treatmentA. 0.5～2.0 cm;B. 2.1～3.0 cm;C. 3.1～4.0 cm;D. 4.1～5.0 cm;E. 5.1～6.0 cm;F. 6.1～7.0 cm. Bar=100 μm.

對低溫處理17 d后不同旗葉距游離的小孢子中單核小孢子所占的比例進(jìn)行統(tǒng)計分析(圖3)。結(jié)果表明,隨著旗葉距的增加,單核小孢子的數(shù)目持續(xù)降低。旗葉距為0.5～2.0 cm時單核小孢子比例達(dá)到71%,顯著高于其他旗葉距的單核小孢子比例;而旗葉距為6.1～7.0 cm時單核小孢子比例僅為5%。

圖3 低溫處理17 d后不同旗葉距單核小孢子比例Fig.3 The rate of mononuclear microspores at different space of flag leaf after 17 days of low temperature treatment不同小寫字母代表在0.05水平差異顯著。下同。Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level.The same below.

2.2 不同旗葉距對小孢子培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)能力的影響

不同旗葉距的小孢子均能產(chǎn)生愈傷組織,愈傷組織產(chǎn)量隨著旗葉距的增大稍有增加(圖4),不同旗葉距的小孢子產(chǎn)生的愈傷組織產(chǎn)量沒有顯著差異。對不同旗葉距的單核小孢子比例與其對應(yīng)的愈傷組織產(chǎn)量的相關(guān)性進(jìn)行分析,二者相關(guān)系數(shù)為-0.89,呈極顯著負(fù)相關(guān)。

圖4 不同旗葉距對小孢子愈傷組織產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of the different space of flag leaf on callus yield of microspores

2.3 不同旗葉距對小孢子愈傷綠苗再生能力的影響

不同旗葉距的小孢子愈傷組織綠苗再生能力差異顯著,隨旗葉距增大綠苗再生能力顯著降低。旗葉距為0.5～2.0 cm的小孢子愈傷組織再生能力顯著高于其他旗葉距的小孢子愈傷組織再生能力,每100 mg愈傷組織能分化出600多株綠苗,是旗葉距為2.1～3.0 cm的1.6倍、6.1～7.0 cm的4.7倍(圖5)。對不同旗葉距的單核小孢子比例與其對應(yīng)的再生能力相關(guān)性進(jìn)行分析,二者相關(guān)系數(shù)為0.96,呈極顯著正相關(guān)。

圖5 不同旗葉距對小孢子愈傷組織(100 mg)再生能力(綠苗數(shù))的影響Fig.5 Effects of the different space of flag leaf on regeneration capacity(green plants)of microspore callus(100 mg)

2.4 不同旗葉距對小孢子再生植株倍性的影響

利用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長度的2個臨界值(37和62 μm),將旗葉距為0.5～2.0 cm、2.1～4.0 cm和4.1～7.0 cm的小孢子再生植株分為單倍體、二倍體和四倍體。為了減少誤差,利用根尖染色體制片技術(shù)對所有分類為單倍體和四倍體的植株以及在這2個臨界值附近的再生植株進(jìn)行驗證。最終一共挑取707株再生植株,其中單倍體的比例為22.77%,二倍體的比例為71.57%,四倍體的比例為5.66%。旗葉距為0.5～2.0 cm的小孢子再生植株單倍體所占比例較大,旗葉距為2.1～4.0 cm和4.1～7.0 cm的小孢子再生植株的四倍體比例相對較大(表1)。圖6為小孢子再生植株單倍體、二倍體和四倍體根尖細(xì)胞染色體。

表1 不同旗葉距小孢子再生植株的倍性分布Table 1 Ploidy distribution of regenerated plants from microspores with different space of flag leaf

圖6 小孢子再生植株中單倍體(n=x=7,A)、二倍體(2n=2x=14,B)和四倍體(2n=4x=28,C)的根尖細(xì)胞染色體Fig.6 The chromosome in the root tip cells of haploid(n=x=7,A),diploid(2n=2x=14,B)and tetraploid(2n=4x=28,C)in regenerated plants from microspores

3 討論與結(jié)論

小孢子發(fā)育階段是影響小孢子胚胎發(fā)生的重要因素之一[17-18]。能夠?qū)φT導(dǎo)處理作出反應(yīng)的小孢子處于一個狹窄的發(fā)育窗口,即使在同一枚花藥內(nèi)也只有一定比例的小孢子會將其正常的配子體途徑轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦芋w發(fā)育途徑[19]。對很多物種而言,小孢子單核晚期或者雙核早期是最適宜的小孢子培養(yǎng)時期[19-20]。本研究中在取材當(dāng)天不同旗葉距的小孢子雖然都處在單核期,但是核的狀態(tài)由致密到分散;經(jīng)過低溫處理后,小孢子出現(xiàn)了單核和二核混合的時期,單核的比例隨著旗葉距的增大逐漸降低,而且單核的比例與綠苗再生能力有密切關(guān)系,因此培養(yǎng)前準(zhǔn)確鑒定小孢子發(fā)育時期對大麥小孢子培養(yǎng)至關(guān)重要。

由于旗葉距的直觀性,利用旗葉距的大小來確定小孢子發(fā)育時期在不同作物的小孢子培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用。在水稻中,旗葉和倒2葉葉節(jié)之間距離為7～11 cm通常被認(rèn)為是小孢子培養(yǎng)的最佳時期[21];胡銳[22]認(rèn)為秈稻葉枕距4～6 cm時花藥已經(jīng)處于單核靠邊期,最適宜進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng);大麥中分離小孢子數(shù)量最多的旗葉距為1.7～5.1 cm[3]。燕麥中旗葉基部至倒2葉基部的距離小于4 cm的圓錐花序能在所有供試品種中形成胚狀體[11]。本研究中大麥‘花30’旗葉距為0.5～7.0 cm均能夠產(chǎn)生愈傷組織,而且不同旗葉距的愈傷組織產(chǎn)量沒有顯著差異,但是綠苗再生能力在不同旗葉距之間差異顯著。旗葉距為0.5～2.0 cm的小孢子愈傷組織產(chǎn)量雖然最少,但其再生能力卻顯著超過其他旗葉距的小孢子,這可能是由于0.5～2.0 cm旗葉距的幼穗中小孢子發(fā)育階段比較適合小孢子培養(yǎng),產(chǎn)生的胚性愈傷組織較多,從而綠苗產(chǎn)量也較高。隨著旗葉距的增大,經(jīng)過低溫預(yù)處理后的小孢子發(fā)育時期發(fā)生變化,雖然產(chǎn)生較多的愈傷組織,但是形成胚性愈傷相對較少,導(dǎo)致綠苗產(chǎn)量下降。不同旗葉距的小孢子再生植株不同倍性的比例分布相近,二倍體占70%左右,單倍體和四倍體為30%左右,旗葉距為0.5～2.0 cm的小孢子再生植株單倍體所占比例較大,旗葉距為2.1～4.0 cm和4.1～7.0 cm的小孢子再生植株的四倍體比例相對較大,這種倍性變化是小孢子發(fā)育不同時期引起的還是后代驗證群體數(shù)目太少引起的,還需要進(jìn)一步驗證。

在田間取材過程中,旗葉距是一個比較明顯的形態(tài)學(xué)指標(biāo),小孢子發(fā)育時期與旗葉距的大小有明顯的相關(guān)性。氣候和田間種植條件等其他因素對小孢子發(fā)育階段也會有很大的影響。不同材料發(fā)育時期不同,需要根據(jù)材料特征,以旗葉距為基本標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合小孢子顯微觀察,來明確最合適的小孢子培養(yǎng)時期,從而降低試驗誤差。