王小松,馬磊,劉志穎,李托,朱瀚,劉東陽,沈其榮

南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室,江蘇 南京 210095)

幾丁質(zhì)又稱為甲殼素,是由β-1,4-糖苷鍵將N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)連接而成的高分子多聚物,廣泛分布在真菌細胞壁及昆蟲、甲殼類動物、線蟲的外骨骼中,是自然界中分布最廣泛的氨基多糖[1]。幾丁質(zhì)脫乙?；a(chǎn)生的殼聚糖,是一種含有GlcNAc和D-葡萄糖胺(GlcN)的聚合物,D-葡萄糖胺通常占殘留物的80%[2]。殼寡糖的生物活性主要取決其分子質(zhì)量及所帶電荷量[3-6],它通常使用化學降解法來制備,而酶促轉(zhuǎn)化是一種更環(huán)保、可控的方法。幾丁質(zhì)酶以隨機的方式水解幾丁質(zhì)糖鏈上的糖苷鍵,水解產(chǎn)物為可溶性低分子質(zhì)量混合物。幾丁二糖酶,可從非還原端裂解幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)聚合物,最終產(chǎn)物為二乙酰幾丁二糖[(GlcNAc)2][7]。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,同樣從非還原端裂解幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)聚合物,最終產(chǎn)物為GlcNAc[8]。產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的微生物主要為細菌、放線菌、真菌,不同微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶并不相同,如釀酒酵母能產(chǎn)生2種幾丁質(zhì)酶cts1和cts2[9]。木霉屬(Trichodermaspp.)真菌廣泛存在于各種生態(tài)系統(tǒng),共包含8個集合種[10],它是一類生長繁殖迅速、適應環(huán)境能力強、高效利用養(yǎng)分和空間的絲狀真菌,寄生在其他真菌細胞表面后通過分泌幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等細胞壁降解酶來實現(xiàn)對真菌細胞壁的溶解,被廣泛應用于生物防治[11-14]。本試驗利用本實驗室保存的一株木霉菌株TrichodermaguizhouenseNJAU4742,通過克隆、表達獲得幾丁質(zhì)酶Chi8,以膠體幾丁質(zhì)為底物,在不同的溫度、pH值、金屬離子條件下測定其酶活性及其熱穩(wěn)定性,再利用質(zhì)譜鑒定其水解產(chǎn)物,旨在為幾丁質(zhì)的資源化利用提供堅實的理論和物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒菌株TrichodermaguizhouenseNJAU4742、質(zhì)粒pET-29a、克隆菌株EscherichiacoliDH5α以及表達宿主E.coliBL21(DE3)均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基液體LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、去離子水1 L,pH7.0。固體LB培養(yǎng)基:在液體LB培養(yǎng)基中加15 g·L-1的瓊脂。

1.1.3 主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ(TaKaRa公司);硫酸卡那霉素、氨芐青霉素(GENVIEW公司);IPTG(北京索萊寶科技有限公司);細胞裂解液(50 mL體系):2.5 mL 1 mol·L-1Tris(pH8.0)、4 mL 5 mol·L-1NaCl、50 μL 0.1 mol·L-1PMSF(苯甲基磺酰氟)、5 mL 50%甘油、38.45 mL ddH2O;甲殼素、殼聚糖、羧甲基殼聚糖(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆基于NJAU4742的基因組數(shù)據(jù)庫(http://bioinfo.njau.edu.cn/tgn4742/)設計引物,正向引物:AGCCCCCTGGCTACAGAAGAG;反向引物:TTAGTTCAGACCGTTCCTGATGTT。提取NJAU4742菌株總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板擴增chi8(A1A104090.1)。PCR反應體系(50 μL):5×Prime STAR?Buffer(Mg2+plus)10 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL,正、反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL,cDNA 1 μL,DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL,滅菌蒸餾水32.5 μL。每個樣品設2個重復。反應條件:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)30次;72 ℃ 10 min,10 ℃ 10 min。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹及Motif分析利用BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov)篩選其他相似序列,在Non-Redundant Protein Sequence數(shù)據(jù)庫中篩選相似度高的31條氨基酸序列,利用1 000個重復的bootstrap值構(gòu)建鄰接樹,檢測序列間的距離,分析Chi8與其他幾丁質(zhì)酶的同源關(guān)系[15]。利用MEME(http://meme-suite.org/index.html)的Motif Discover工具預測不同蛋白序列的Motif信息。

1.2.3 載體構(gòu)建及熱激轉(zhuǎn)化將20 μL反應體系(2 μLEcoRⅠ,2 μLKpnⅠ,14 μL pET-29a質(zhì)粒與2 μL 10×M Buffer)混合均勻,在37 ℃水浴鍋中進行雙酶切20 h后回收酶切產(chǎn)物。用T4連接酶在16 ℃條件下反應16 h。將酶連產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細胞混合,放置冰上30 min,轉(zhuǎn)移至42 ℃水浴鍋中熱激90 s,再置于冰上2 min,轉(zhuǎn)移至裝有900 μL LB培養(yǎng)基的滅菌離心管中,于37 ℃、100 r·min-1搖床上復蘇1 h,4 ℃、3 000～5 000 r·min-1離心3 min,沉淀重懸后取100 μL涂布在LA(LB培養(yǎng)基中添加50.0 mg·L-1氨芐青霉素)固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)14～16 h。挑選轉(zhuǎn)化子進行驗證。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶的異源表達、純化和驗證將陽性克隆轉(zhuǎn)接至添加30 mg·L-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、200 r·min-1的搖床上培養(yǎng),當D600達到0.5時,每升培養(yǎng)基中加入0.5 mmol IPTG進行誘導,同時將培養(yǎng)條件改為16 ℃、100 r·min-1培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后在4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min,收集菌體,利用1×PBS溶液進行重懸,將重懸液轉(zhuǎn)移至50 mL新離心管中,在4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min,棄上清液后稱重。將菌體與細胞裂解液以1∶10(質(zhì)量體積比)的比例混合后進行重懸,在冰水混合物中超聲破碎菌體后,4 ℃、8 000 r·min-1離心1 h,利用SDS-PAGE分析驗證。

利用蛋白純化儀(NGC10,伯樂)純化上述制備的胞內(nèi)總蛋白。平衡液(pH8.0)為50 mmol·L-1NaH2PO4、300 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1咪唑,0.22或0.45 μm濾膜過濾除菌;洗脫液(pH8.0)為50 mmol·L-1NaH2PO4、300 mmol·L-1NaCl、500 mmol·L-1咪唑,0.22 μm濾膜過濾除菌。梯度洗脫后得到Chi8純化蛋白,用Bradford方法測定蛋白濃度,利用SDS-PAGE分析純化的Chi8蛋白。

蛋白鑒定主要儀器:冷凍干燥儀(上海盧湘)、EASY-nLC1000系統(tǒng)(Thermo Scientific)、LTQ Orbitrap Velos Pro(Thermo Scientific);主要試劑:脫色液[25 mmol·L-1NH4HCO3、50%(體積分數(shù))乙腈水溶液]、脫水液1(50%乙腈水溶液)、脫水液2(100%乙腈)、還原液1(含10 mmol·L-1DTT和25 mmol·L-1NH4HCO3的水溶液)、還原液2(含50 mmol·L-1碘乙酰胺和25 mmol·L-1NH4HCO3水溶液)、吸脹液(25 mmol·L-1NH4HCO3水溶液)、酶解覆蓋液(25 mmol·L-1NH4HCO3水溶液)、酶解工作液(含0.02 μg·μL-1胰蛋白酶的酶解覆蓋液)、肽段萃取液(含5%甲酸、67%乙腈的水溶液)。

1.2.5 Chi8酶學特性及其對膠體幾丁質(zhì)的水解動力學參數(shù)測定膠體幾丁質(zhì)的制備和標準曲線的制作:稱取5 g幾丁質(zhì)緩慢加入100 mL濃鹽酸中,并用磁力攪拌器混勻,4 ℃環(huán)境下放置24 h后加入300 mL 50%(體積分數(shù))的乙醇溶液,然后用去離子水洗至溶液呈中性。N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線配制方法:用1 mg·mL-1N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準溶液制備不同濃度的溶液,并與DNS反應后在酶標儀520 nm波長下測定吸光值,將N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量作為縱軸,吸光值作為橫軸繪制標準曲線(y=0.147 7x-0.003 7,R2=0.993 7)。

不同條件下幾丁質(zhì)酶活性的測定:測定方法根據(jù)文獻[13,16]的方法進行適當調(diào)整。1 mL反應體系包括20 μL幾丁質(zhì)酶液、400 μL膠體幾丁質(zhì)、580 μL醋酸緩沖液(pH6.0);對照(CK)加入20 μL的滅活酶液(反應體系中蛋白量為0.5 μmol)。37 ℃、200 r·min-1條件下反應1 h后轉(zhuǎn)移至冰上,離心后取上清液與等體積DNS混勻,沸水浴10 min,冷卻后520 nm波長下利用酶標儀測定吸光值。以1 μmol酶溶液1 h產(chǎn)生的還原糖定義為1個酶活性單位(U),每個處理3個重復。測定不同pH值對酶活性的影響時,分別加入pH值為4.0、5.0的磷酸緩沖液,pH值為5.0、6.0、7.0的醋酸緩沖液和pH值為7.0、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖液。測定溫度對酶活性的影響時,溫度梯度設定為20、30、40、50、60、70和80 ℃。測定金屬離子對酶活性的影響時,分別加入100 μL 50 mmol·L-1的NaCl、CaCl2、FeCl3、CoCl2、CuCl2溶液,同時加入480 μL醋酸緩沖液。測定Chi8熱穩(wěn)定性時,分別將蛋白在30、37、40、43、47和50 ℃條件下水浴處理20、40、60、80、100和120 min。測定Chi8底物特異性時,底物分別為膠體幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)、羧甲基殼聚糖、殼聚糖。

1.2.6 降解產(chǎn)物分析在50 mL反應體系中分別加入20 mL膠體幾丁質(zhì)、29 mL醋酸緩沖液(pH6.0)、1 mL 幾丁質(zhì)酶液,37 ℃、200 r·min-1反應12 h,得到水解產(chǎn)物。將上述產(chǎn)物11 000 r·min-1離心去除剩余底物,上清液與氯仿、正丁醇按體積比25∶4∶1混勻,劇烈搖晃20 min,高速離心去除變性蛋白質(zhì),利用考馬斯亮藍法檢測殘留蛋白。利用碳柱(SupelcleanTMENVI-CarbTMSPE 管)洗脫去除鹽離子,用不同濃度乙腈+三氟乙酸混合溶液梯度洗脫,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5后,利用MALDI-TOF/MS檢測產(chǎn)物的成分。

1.2.7 Chi8的同源結(jié)構(gòu)建模及底物模擬對接利用SMART(smart.embl-heidelberg.de)在線預測Chi8的結(jié)構(gòu)域,選中g(shù)enomic模式,對Chi8的氨基酸序列進行比對;利用SWISS-MODEL(swissmodel.expasy.org)將Chi8的氨基酸序列與PDB數(shù)據(jù)庫已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進行比對來預測模型,并利用PyMOL軟件進行優(yōu)化,得到蛋白同源結(jié)構(gòu)[17]。利用AutoDock(http://autodock.scripps.edu/)對Chi8進行半柔性對接(其中受體蛋白設為剛性,配體小分子設為柔性),利用分子軟件提取配體(幾丁六糖),并利用Autodock toolkit加氫,計算電荷,確認質(zhì)子化狀態(tài)后保存為ligand.pdb,作為分子對接的配體結(jié)構(gòu)。將Chi8的同源結(jié)構(gòu)蛋白刪掉多余的水分子,保存為protein.pdb,作為分子對接的受體結(jié)構(gòu),最后用AutoDock Tools將配體和受體進行對接。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆及其生物信息學分析

將PCR擴增獲得的chi8完整片段進行瓊脂糖凝膠電泳分析,獲得約為1 200 bp條帶,與理論片段長度 1 224 bp相符(圖1-A)。目的基因與pET-29a融合后獲得重組質(zhì)粒pET-29a-chi8,其電泳條帶約為 4 600 bp,也與理論片段相符(圖1-B)。選取31種來源于不同微生物的幾丁質(zhì)酶基因序列進行分析,根據(jù)相似性高低可將其分為3個主要的聚類,第Ⅰ類全部屬于木霉屬真菌,其中哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶(ACM47359)與chi8的序列相似度高達93.38%。第Ⅱ、Ⅲ類中主要包括青霉屬(Purpureocilliumlilacinum)、Escovopsis屬(Escovopsisweberi)和葡萄穗霉屬(Stachybotryselegans)等,這些真菌具有一些相同的生物特性,如對外界條件適應性強,代謝能力強,可以利用纖維素、幾丁質(zhì)等高聚合物作為碳源。chi8具有7個典型的Motif,與哈茨木霉和土孢木霉的幾丁質(zhì)酶完全一致,因此可以推測chi8與兩者功能一致,具有良好的幾丁質(zhì)水解活性(圖1-C)。

圖1 幾丁質(zhì)酶chi8基因的克隆及其信息學分析Fig.1 Cloning and informatics analysis of chitinase chi8 geneA. chi8完整片段的電泳圖;B. 重組質(zhì)粒的電泳圖(M. DNA標準品;泳道1為pET-29a空載質(zhì)粒線性化片段,泳道2為pET-29a-chi8重組質(zhì)粒線性化片段);C. chi8基因信息分析(左圖為基因序列比對結(jié)果,右圖為對應基因的功能模塊分析)。A. The electrophoretic image of complete chi8 fragment;B. The electrophoretic image of the linearized recombinant plasmid(M is the marker,lane 1 is the linearized fragment of pET-29a,lane 2 is the linearized fragment of PET-29A-chi8 recombinant plasmid);C. The gene information analysis of chi8(The left is the gene sequence alignment result,and the right one is the functional module analysis of the corresponding gene).

2.2 Chi8的表達、純化與質(zhì)譜鑒定

利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對chi8進行誘導表達,每升培養(yǎng)基加入0.5 mmol·L-1IPTG培養(yǎng)一段時間后,可以成功誘導目的基因表達,表達蛋白的電泳分析結(jié)果如圖2所示。以空載菌株表達的蛋白條帶1作為對照,在2、3蛋白條帶相對分子質(zhì)量約46×103的位置清晰可見1條新的蛋白條帶,而且蛋白條帶比較濃。該條帶的相對分子質(zhì)量與理論相對分子質(zhì)量(46.365×103)相近,說明NJAU4742菌株的幾丁質(zhì)酶基因chi8已在大腸桿菌BL21中成功表達。為了進一步驗證表達的蛋白為目的蛋白,將該蛋白進行特征性肽段的質(zhì)譜鑒定。根據(jù)LC-MS蛋白肽段鑒定結(jié)果(結(jié)果未展示),共檢測到17條用于蛋白質(zhì)鑒定分析的肽段,其中4個特征性的肽段(AGATIQYDSVAK、ALGG-LDTTQNLLSYPNSK、ANGYANSVYFTNWGIYDR、ANG-YASVYFTNWGIYDR)與NJAU4742菌株中幾丁質(zhì)酶Chi8肽段的覆蓋率高達51.16%。因此,蛋白質(zhì)電泳結(jié)果和特征性肽段質(zhì)譜檢測結(jié)果表明,純化蛋白是來源于貴州木霉NJAU4742菌株的幾丁質(zhì)酶Chi8。

圖2 Chi8的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of Chi8M. 標準蛋白;1. pET-29a空載轉(zhuǎn)化菌株胞內(nèi)總蛋白;2. pET-29a-chi8轉(zhuǎn)化菌株胞內(nèi)總蛋白;3. 純化后的蛋白。M. The standard protein marker;1. Total intracellular protein of the pET-29a transformed strain;2. Total intracellular protein of pET-29a-chi8 transformed strain;3. Purified protein.

2.3 Chi8的酶學性質(zhì)分析

從圖3-A可知:幾丁質(zhì)酶Chi8在30～40 ℃的酶活性比較高,而在低溫下(20 ℃左右)依舊能保持較高活性,溫度達到50 ℃時酶活性顯著降低,溫度繼續(xù)升高后則基本失活,可能是在高溫條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,不能形成與底物結(jié)合的空間結(jié)構(gòu),從而失去降解底物的能力。從圖3-B可知:5 mmol·L-1Ca2+可以顯著提高Chi8的酶活性,能夠達到原酶活性的110.62%,而5 mmol·L-1Co2+、Cu2+對Chi8具有顯著抑制作用,與酶作用后分別下降到原酶活性的89.70%和60.17%。尤其是添加5 mmol·L-1Fe3+時,酶活性下降到原來的5.93%。從圖3-C可知:Chi8酶活性在pH6.0時達到最高,其中偏酸性條件抑制效應更明顯,在pH4.0時基本失去活性,而在pH9.0時仍保留了部分酶活性,可達到最高酶活性的50%。

圖3 不同條件下Chi8酶活性的變化Fig.3 The changes of enzyme activity of Chi8 in different conditions不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。The different small letters indicated significant difference in treatments at 0.05 level. The same as follows.

從圖3-D可知:在相同的熱處理時間(40 min)內(nèi),隨著熱處理溫度的升高,酶活性顯著降低。在30、37、40和43 ℃熱處理條件下,相對于熱處理溫度升高對酶活性造成的顯著影響,熱處理時間增加對酶活性影響相對較小,隨著處理時間增加,酶活性基本不變;47 ℃熱處理條件下,隨處理時間增加,酶活性下降明顯;在50 ℃熱處理條件下,在初始的20 min內(nèi)酶活性基本喪失。因此,幾丁質(zhì)酶Chi8在30～43 ℃可以保持較好的熱穩(wěn)定性;當溫度高于47 ℃后蛋白迅速失活,酶活性受抑制,并且隨著時間延長而更明顯。

從圖4可知:Chi8對膠體幾丁質(zhì)具有良好的分解效果,也能分解羧甲基殼聚糖,而基本沒有分解幾丁質(zhì)和殼聚糖的能力;延長反應時間對于底物降解效果并不顯著。因此,Chi8并不能直接降解幾丁質(zhì),需要對幾丁質(zhì)做預處理或者與其他幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用才能實現(xiàn)對幾丁質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化。

圖4 不同底物對Chi8比酶活性的影響Fig.4 The effect of different substrates on specific enzyme activity of Chi8

2.4 Chi8降解膠體幾丁質(zhì)的水解產(chǎn)物鑒定

為了闡明Chi8對膠體幾丁質(zhì)的催化特性,利用MALDI-TOF/MS法對水解產(chǎn)物進行分析(圖5)。Chi8水解膠體幾丁質(zhì)后形成了不同的多糖,降解產(chǎn)物中以幾丁二糖[(GlcNAc)2]豐度最高,其豐度大于1 800;除此之外,還檢測到單糖。這表明Chi8降解膠體幾丁質(zhì)的最終產(chǎn)物以低聚糖為主,尤其以幾丁二糖為主。

圖5 Chi8降解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物Fig.5 Degradation of colloidal chitin products by Chi8

2.5 Chi8的同源蛋白結(jié)構(gòu)預測及底物模擬對接

Chi8的結(jié)構(gòu)域和同源蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,其與GH18家族關(guān)系密切。Chi8的結(jié)構(gòu)具有較低的復雜性,只含有1個Glyco-18結(jié)構(gòu)域(17～368),E值為5.53 e-143,其主要功能為結(jié)合膠體幾丁質(zhì)。由圖6-A可知,Chi8蛋白同源結(jié)構(gòu)模型由18個螺旋和15個β-折疊組成,末端的1個免疫缺乏因子(immune deficiency,IMD)殘基為咪唑環(huán),殘基相對分子質(zhì)量為69.08,廣泛存在于748種蛋白結(jié)構(gòu)中,包括5ZBJ、3QK1、4P8T等蛋白。蛋白與底物對接結(jié)果表明,有4個氨基酸殘基與配體相互作用,同時還存在5個蛋白質(zhì)配體相互作用通道,主要以氫鍵和π堆垛的形式相互作用(圖6-B)。將幾丁六糖模擬成活性物質(zhì)與模擬的Chi8三維結(jié)構(gòu)進行對接,對接結(jié)果展示了該蛋白與幾丁六糖結(jié)合的位點Asn197、Trp110、Tyr218、Arg274、Arg31,這些位點可能為該蛋白的活性中心。

圖6 Chi8的同源蛋白結(jié)構(gòu)模型(A)及底物模擬對接(B)Fig.6 The homologous protein structure model(A)and substrate simulation docking of Chi8(B)

3 討論

幾丁質(zhì)及其衍生物在工業(yè)、農(nóng)業(yè),尤其是生物醫(yī)藥等方面具有巨大的應用前景,因此研究利用高活性幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生殼聚糖具有重要意義。GH18家族中大多數(shù)幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域均包含1個碳水化合物結(jié)合模塊(CBM54),同時還具備1個或多個幾丁質(zhì)酶催化域,如ChiW[18]和Tc-ChiD[19]的結(jié)構(gòu)域中均包含1個SLH結(jié)構(gòu)域。TIM-barrel是GH18家族幾丁質(zhì)酶中常見的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),這一類蛋白是由1個半桶進化而來,每1個半桶自身不具備生物學功能,2個半桶合在一起共同作用才能發(fā)揮蛋白質(zhì)的功能。Chi8蛋白中同樣含有TIM-barrel結(jié)構(gòu),但是Chi8只有1個Glyco-18結(jié)構(gòu)域用于結(jié)合底物,因此催化能力稍微偏低且不能直接分解幾丁質(zhì)和殼聚糖。

不同種類和來源的幾丁質(zhì)酶對酸堿適應性差異較大,通常最佳pH值范圍為3.0～10.0[20-22],本研究中Chi8的最佳pH值約為6.0。Wang等[23]從Pseudoalteromonassp. DL-6獲得1個非隱性內(nèi)源性幾丁質(zhì)酶ChiA,其最佳pH值為9.0。不同幾丁質(zhì)酶的最適溫度也有較大的差異,大部分幾丁質(zhì)酶在40～50 ℃酶活性保持穩(wěn)定,溫度繼續(xù)升高將會完全失去酶活性[7-9]。本研究中,Chi8在30～40 ℃具有很高的酶活性,且具有較好的熱穩(wěn)定性,當溫度達到50 ℃時基本失去活性,說明來源于NJAU4742的幾丁質(zhì)酶Chi8的熱穩(wěn)定性并不理想。不同金屬離子對幾丁質(zhì)酶Chi8的酶活性影響比較大,Co2+、Fe2+、Fe3+及Hg2+對大部分幾丁質(zhì)酶活性具有抑制作用,而Mg2+、Ca2+及Mn2+等具有增強作用[24]。一般情況下,金屬離子可能會影響蛋白分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和多種酶的催化活性,幾丁質(zhì)酶和底物結(jié)合過程需要鹽離子形成鹽橋加以穩(wěn)定;另外一些鹽可以減輕蛋白表面的靜電力,從而使蛋白不容易形成紊亂結(jié)構(gòu),降低蛋白不可逆失活的概率[25]。幾丁質(zhì)酶水解膠體幾丁質(zhì)后可產(chǎn)生不同的殼寡糖,Suginta等[26]檢測到水解產(chǎn)物中從GlcNAc到(GlcNAc)6都有分布,其中以(GlcNAc)2和(GlcNAc)4為主,并且隨反應時間延長,水解產(chǎn)物呈現(xiàn)(GlcNAc)2增加的趨勢,說明(GlcNAc)4可以進一步被降解。本研究中,Chi8水解膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物只檢測到(GlcNAc)2和單糖,Ueda等[27]也獲得了相似的結(jié)果。這主要是因為幾丁質(zhì)酶在水解幾丁質(zhì)多聚物時隨著反應時間延長,水解產(chǎn)物逐漸由幾丁多糖轉(zhuǎn)化為幾丁二糖并不斷累積。

目前,關(guān)于幾丁質(zhì)酶的研究較多,但由于幾丁質(zhì)酶的多樣性和復雜性,再加上自然界分泌的幾丁質(zhì)酶活性低等因素,導致幾丁質(zhì)酶的工業(yè)化生產(chǎn)還存在較多的問題。另外,國內(nèi)對于幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領域的研究起步晚,對于幾丁質(zhì)酶在抗蟲、抗菌中的具體機制至今尚未明確,亟需更深入的研究。隨著幾丁質(zhì)酶理論基礎和應用研究日益受到重視,幾丁質(zhì)酶的研究已成為糖化學催化領域中不可忽視的分支,在環(huán)境、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領域具有十分廣闊的應用前景。