展恩玲,盛成旺,陳煜明,唐濤,趙春青*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,湖南 長沙 410125)

蛋白指示標(biāo)簽,包括短肽、表位標(biāo)記、折疊蛋白標(biāo)記和非色譜標(biāo)記等,作為一種重要的生物分子研究輔助工具已被廣泛應(yīng)用,并大幅度簡化蛋白質(zhì)的異源重組表達(dá)和純化過程[1-2]。其中,常用的可視化蛋白標(biāo)簽多為熒光蛋白,如綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)和單體紅色熒光蛋白(monomeric red fluorescent protein,mRFP)等。熒光蛋白主要用于監(jiān)測經(jīng)其標(biāo)記的靶標(biāo)蛋白在活細(xì)胞或組織內(nèi)的動態(tài)過程[3],其優(yōu)點在于無需外源性底物和輔助因子即可在長波紫外輻射(ultraviolet,UV)下被激發(fā)[4-6]。因此,熒光蛋白均需UV-激發(fā)或利用熒光成像技術(shù)才能觀測到顏色[7]。此外,熒光蛋白的光譜與結(jié)構(gòu)特征相互依賴[5],其成本高且分子質(zhì)量太大會干擾蛋白的表達(dá)[2]。因此,在原核系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白時,常用成本較低且分子質(zhì)量較小的His和GST標(biāo)簽[1]。但這些標(biāo)簽在蛋白表達(dá)和純化過程中無顯色特性,造成檢測結(jié)果后延,操作技術(shù)復(fù)雜,如需免疫印跡(Western blot)等檢測技術(shù),耗時耗力。因此,研發(fā)一種新穎并兼具上述優(yōu)點的可視化蛋白標(biāo)簽來簡便蛋白重組表達(dá)和純化進(jìn)程將尤為必要。

細(xì)胞色素b5(cytochrome b5,Cyt-b5)是一類含有輔基原卟啉Ⅸ(血紅素,heme)的金屬蛋白,在生物體內(nèi)作為電子轉(zhuǎn)移元件參與多種重要的氧化還原反應(yīng)[8]。它在紅細(xì)胞中以可溶蛋白形式存在并介導(dǎo)高鐵血紅蛋白還原[9],是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜微電子傳遞鏈的組成部分[9-10]。輔基亞鐵血紅素作為Cyt-b5的主要功能域,因其鐵離子價態(tài)的可逆變化,而具有接收和傳遞單個電子的功能;同時,當(dāng)其原有的酶活性被保留時,亞鐵血紅素使蛋白呈紅色[11]。已有研究表明,岡比亞按蚊(AnophelesgambiaeGiles)和大鼠(Rattusnorve-gicusBerkenhout)的Cyt-b5可在原核表達(dá)系統(tǒng)中作為可視化的紅色標(biāo)簽[7,12]。pGEX-Cyt-b5載體原核表達(dá)的GST-Cyt-b5融合蛋白可經(jīng)谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析柱純化,并能通過免疫印跡法(Western blot)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定;此外,融合蛋白的Cyt-b5與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)的蛋白間相互作用很弱,Cyt-b5的存在并未對GST產(chǎn)生顯著的結(jié)構(gòu)和功能的改變[12]。

本研究選擇南京農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理生化與分子生物學(xué)實驗室常用試蟲[13]——二化螟(ChilosuppressalisWalker)的Cyt-b5基因為研究對象,將含Cyt-b5類血紅素/類固醇結(jié)合域(Cyt-b5D)的表達(dá)片段分別用3種原核表達(dá)載體[pET-28a(+)、pET-41a(+)和pET-30a(+)]進(jìn)行異源表達(dá),篩選出顯色穩(wěn)定的基因片段以及菌液顯色的培養(yǎng)時間;進(jìn)一步將顯色穩(wěn)定的片段與二化螟γ-氨基丁酸受體亞基RDL1(resistance to dieldrin 1)基因進(jìn)行融合表達(dá),觀察融合蛋白顯色情況,從而明確選擇片段與目的基因融合表達(dá)時顯色的穩(wěn)定性,篩選出可在3種pET載體上穩(wěn)定顯色的最小片段和最佳的顯色時間點,以期為其成為原核表達(dá)系統(tǒng)可視化標(biāo)簽提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Trizol試劑購于美國Invitrogen公司;Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit與ExTaq酶購于大連TaKaRa公司;pEASY-T3載體、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、Trans2K DNA Marker、Trans5K DNA Marker、TransT1感受態(tài)細(xì)胞和DNA凝膠回收試劑盒等購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;10× Fast Diagest Green Buffer、Fast DiagestBamHⅠ和Fast DigestXhoⅠ購于美國Thermo Scientific公司;10× T4DNA Ligase、10× T4DNA Ligase Buffer和質(zhì)粒小量提取試劑盒購于美國Promega公司;抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于金斯瑞生物科技有限公司;免疫化學(xué)印記化學(xué)發(fā)光試劑盒購于臺灣生工科技有限公司;表達(dá)載體pET-28a(+)、pET-41a(+)和pET-30a(+)及二化螟由本實驗室提供[14]。

1.2 方法

1.2.1 二化螟Cyt-b5氨基酸序列的劃分根據(jù)二化螟Cyt-b5序列,對其氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,將其劃分成O、A、B、C共4個區(qū)域(圖1),選擇含Cyt-b5的A(8～81 aa)、OA(1～81 aa)、AB(8～109 aa)、OB(1～109 aa)、AC(8～132 aa)及OC(1～132 aa)等6個長度不同的潛在顯色片段用于后續(xù)試驗。

圖1 細(xì)胞色素b5的結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Domain analysis of cytochrome b5數(shù)字代表氨基酸位置;棕色六邊形為Cyt-b5類血紅素/類固醇結(jié)合域(Cyt-b5D);粉紅色長方形為低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域;藍(lán)色長方形為跨膜結(jié)構(gòu)域。The number indicates the location of the amino acid;the brown hexagon is cytochrome b5-like heme/steroid binding domain(Cyt-b5D);the pink rectangle is low complexity region;and the blue rectangle is transmembrane region.

1.2.2 二化螟Cyt-b5和RDL1基因的克隆采用Trizol法提取二化螟的總RNA,并用Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。以cDNA為模板,利用ExTaq酶和特異性引物(表1)分別擴(kuò)增目的基因片段。其中,A、OA、AB、OB、AC及OC片段的PCR反應(yīng)程序為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)35次;72 ℃ 10 min。RDL1的PCR反應(yīng)程序為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,47 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)35次;72 ℃ 5 min。經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測后,純化和回收目的基因片段,并將其連接至pEASY-T3載體上,再轉(zhuǎn)至TransT1感受態(tài)細(xì)胞中,涂板過夜培養(yǎng);挑取單克隆白菌斑擴(kuò)大培養(yǎng)后送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序;抽提測序正確的質(zhì)粒,測定濃度后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及其異源表達(dá)利用相應(yīng)的內(nèi)切酶對測序正確的質(zhì)粒以及原核表達(dá)載體pET-28a(+)、pET-41a(+)和pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切,然后將6個目的片段分別與pET-28a(+)載體連接,轉(zhuǎn)至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),加入1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后,以pET-28a(+)空載體為對照,比較不同片段表達(dá)蛋白的菌液顏色。將篩選后的潛在顯色片段A、OA和OB分別與pET-30a(+)載體連接,重復(fù)上述操作,收集0、1、2、4和8 h的菌液,并以pET-30a(+)空載體為對照,觀察和比較其顏色變化。同時,將OA片段與pET-41a(+)載體連接,重復(fù)上述操作,收集0、1、2、3.5、5、7和14 h的菌液,并以pET-41a(+)空載體為對照,觀察和比較其顏色變化,同時用分光光度計測定不同波長下菌液的吸光值。

1.2.4 顯色片段與RDL1的融合表達(dá)將測序正確雙酶切RDL1片段分別與pET-30a(+)-A、pET-30a(+)-OA和pET-30a(+)-OB連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌,加入1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,于0、1、2、4和8 h收集菌液,觀察和對比顏色變化。

1.2.5 融合蛋白的純化和檢測將活化的菌液pET-30a(+)-A、pET-30a(+)-OA和pET-30a(+)-OB擴(kuò)大培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時,加入1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并在200 r·min-1、37 ℃條件下培養(yǎng)8 h;然后在4 ℃、8 000g離心10 min,收集菌體。用含0.5 mmol·L-1PMSF的20 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液懸浮菌體,加入溶菌酶(終濃度為0.4 mg·mL-1),在冰浴條件下超聲波破碎3次;在4 ℃、12 000g離心 30 min,收集上清液。將上清液通過鎳親和層析柱,用清洗緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,250 mmol·L-1NaCl,15 mmol·L-1咪唑;pH7.4)清洗層析柱,再用洗脫緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,250 mmol·L-1NaCl,400 mmol·L-1咪唑;pH7.4)洗脫目的蛋白。

目的蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法初檢后,使用Western blot方法進(jìn)一步驗證。具體操作如下:1)采用半干轉(zhuǎn)移法,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用牛血清白蛋白(BSA)于4 ℃過夜封閉;2)以抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體為一抗,稀釋2 000倍,孵育1 h;3)PBS緩沖液洗膜3次,每次5 min,以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,稀釋10 000倍,孵育1 h;4)PBS緩沖液洗膜3次,每次5 min,利用免疫化學(xué)印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒在UVP凝膠成像系統(tǒng)中顯色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色片段篩選和表達(dá)載體普適性測定

2.1.1 Cyt-b5各片段的顯色與對照pET-28a(+)空載體相比,在含有Cyt-b5D不同片段的菌液中,除A和AC片段表達(dá)的菌液顯色不明顯外,其他片段表達(dá)的菌液均呈紅色,其中OA和OB片段顯色最明顯(圖2)。

圖2 pET-28a(+)載體上Cyt-b5各片段的顯色Fig.2 Chromogenic results of each fragment of Cyt-b5 protein on pET-28a(+)vector A、OA、AB、OB、AC和OC分別為Cyt-b5的 8～81 aa、1～81 aa、8～109 aa、1～109 aa、8～132 aa和1～132 aa片段表達(dá)的蛋白;pET-28a(+)為對照。A,OA,AB,OB,AC and OC are the proteins expressed by 8-81 aa,1-81 aa,8-109 aa,1-109 aa,8-132 aa and 1-132 aa fragments of Cyt-b5;pET-28a(+)is the control.

2.1.2 OA片段在不同時間點表達(dá)菌液的顯色及在不同波長下的吸光值將OA片段與pET-41a(+)載體連接并表達(dá),通過比較不同時間點的菌液發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)2 h,菌液開始出現(xiàn)明顯的紅色,并隨培養(yǎng)時間的延長逐漸變深;而空載pET-41a(+)菌體在14 h時仍無顏色變化(圖3-A)。此外,不同時間點收集的菌液在420 nm波長處有1個明顯的吸收峰,且吸光值與時間呈正相關(guān)趨勢(圖 3-B)。

圖3 OA片段與pET-41a(+)連接表達(dá)菌液在不同時間點的顯色反應(yīng)(A)和吸光值(B)Fig.3 Chromogenic reaction(A)and absorbance(B)of pET-41a(+)-OA bacterial solution at different time points

2.1.3 顯色片段與RDL1融合表達(dá)菌液的顏色變化將A、OA及OB片段分別與pET-30a(+)載體連接并進(jìn)行蛋白表達(dá),結(jié)果(圖 4-A)表明:菌液培養(yǎng)2 h時,A片段顯色不明顯,而OA和OB片段開始顯紅色;而培養(yǎng)4和8 h時,A、OA和OB片段表達(dá)的菌液均呈現(xiàn)明顯的紅色。將A、OA和OB片段分別與RDL1融合表達(dá),結(jié)果(圖4-B)表明:菌液培養(yǎng)2 h時,RDL1-OA和RDL1-OB的菌液開始顯紅色,而RDL1-A的菌液無顯色;同樣,培養(yǎng)4和8 h時,3個片段與RDL1融合的菌液均呈現(xiàn)出明顯的紅色。

圖4 Cyt-b5各片段表達(dá)菌體(A)及其與RDL1融合蛋白表達(dá)菌體(B)的實時顯色Fig.4 Chromogenic results of each Cyt-b5 fragment(A)and co-expression of Cyt-b5 fragments with RDL1(B)at different time points

2.2 顯色片段及其與RDL1融合表達(dá)蛋白的純化和免疫印記分析

用鎳離子親和層析柱將裂解后的蛋白樣品進(jìn)行純化。上樣后,當(dāng)層析柱開始出現(xiàn)紅色時(圖5-A),表示目的蛋白與層析柱結(jié)合;在使用洗脫液洗脫后,層析柱中不再有紅色出現(xiàn)(圖5-B),表明目的蛋白已經(jīng)被洗脫完畢;洗脫后收集到的樣品液呈紅色(圖5-C)。

圖5 蛋白純化過程中的顯色Fig.5 Chromogenic results in the process of protein purificationA為上樣后帶蛋白的層析柱;B為蛋白洗脫后的層析柱;C為純化后的樣品液。A is the chromatographic column with protein after sample loading;B is the chromatographic column after protein elution;C is the protein sample after protein purification.

氨基酸序列分析結(jié)果表明,pET-30a(+)空載體、A、OA、OB、RDL1-A、RDL1-OA和RDL1-OB的蛋白相對分子質(zhì)量分別為8.1×103、16.5×103、17.1×103、20.2×103、26.3×103、26.9×103和30×103。Western blot檢測結(jié)果(圖6)顯示,洗脫得到的蛋白樣品條帶清晰,且目的條帶與預(yù)測的蛋白相對分子質(zhì)量大小相符。

3 結(jié)論與討論

作為蛋白標(biāo)簽應(yīng)該具備以下特點:1)一步吸附純化;2)對標(biāo)記蛋白的三級結(jié)構(gòu)和生物活性影響較小;3)容易被特異性去除以產(chǎn)生天然的蛋白;4)在純化過程中對重組蛋白的測定應(yīng)該是簡單且準(zhǔn)確的;5)適用于多種不同的蛋白質(zhì)[15]。為此,蛋白標(biāo)簽已被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的純化和鑒別?？梢暬瘶?biāo)簽作為一種簡單有效的蛋白檢測工具,可大幅度簡化蛋白表達(dá)和純化的過程。Cyt-b5已在諸多研究中作為顯色標(biāo)簽使用。例如,用pLW01載體表達(dá)兔的Cyt-b5蛋白,發(fā)現(xiàn)表達(dá)細(xì)胞中有明顯的粉紅色顆粒[16];利用pHcb5載體表達(dá)人的Cyt-b5蛋白,經(jīng)純化后得到紅色蛋白[17]。

本研究中,含Cyt-b5D的4個片段OA、AB、OB和OC分別與原核表達(dá)載體pET-28a(+)連接,其表達(dá)菌體均呈現(xiàn)明顯的紅色;將含Cyt-b5D的3個片段A、OA和OB分別與原核表達(dá)載體pET-30a(+)連接,其表達(dá)菌體亦呈現(xiàn)明顯的紅色。因此,選擇在2種載體上顯色穩(wěn)定并片段較短的OA片段(1～81 aa)作為最佳顯色片段。OA與pET-41a(+)連接,其表達(dá)菌液反應(yīng)時間越長顯色越明顯;同時,該菌液在420 nm具有顯著的吸收峰,且吸收值與表達(dá)時間呈正相關(guān)趨勢,這與他人的研究結(jié)果[12,18]相符。Fox等[19]將人的Cyt-b5蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein,MBP)在原核表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá),得到的His8-MBP-fl-Cyt-b5蛋白在420 nm波長處有1個明顯的吸收峰。牛衛(wèi)寧等[18]基于人的胱硫醚β-合酶血紅素結(jié)合域片段基因的氨基酸序列開發(fā)出的血紅素融合標(biāo)簽在420 nm處亦具有特征吸收峰,且融合蛋白表現(xiàn)為肉眼可見的鮮紅色。Asher等[20]使用吡啶血紅素吸光度法測定血紅素濃度,進(jìn)而用于血紅素標(biāo)記蛋白質(zhì)的定量。因此,通過檢測特征吸收峰下的吸光值差異,可快速計算表達(dá)蛋白的濃度,而其表達(dá)量與吸光值呈正相關(guān)[20-21],這將大幅度簡化判斷重組蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)量變化的監(jiān)測流程。

本研究還對顯色蛋白及其與RDL1的融合蛋白進(jìn)行純化和鑒定。在使用鎳離子親和層析柱純化過程中,可根據(jù)層析柱顏色的變化實時觀察蛋白的純化過程,最后通過Western blot準(zhǔn)確鑒定出表達(dá)的目的蛋白。蛋白標(biāo)簽的分子質(zhì)量大小與重組蛋白的溶解度緊密關(guān)聯(lián)[15]。本研究結(jié)果表明,Cyt-b5蛋白可視標(biāo)簽的最佳片段OA表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量為17.1×103,小于GST(26×103),說明其有助于提高重組蛋白的溶解度,從而增加重組蛋白的產(chǎn)量[21]。此外,已有研究表明,融合蛋白的Cyt-b5與GST的蛋白間相互作用很弱,Cyt-b5的存在并未顯著改變GST的結(jié)構(gòu)和功能[12]。

綜上所述,本研究利用二化螟Cyt-b5基因探究其不同長度顯色片段在原核表達(dá)系統(tǒng)顯色的穩(wěn)定性和普適性。研究結(jié)果表明:OA片段為最佳選擇,該片段具有顯色穩(wěn)定以及在不同表達(dá)載體上的普適性;同時,無論在原核表達(dá)培養(yǎng)階段,還是蛋白純化過程中,均可在自然光下實時觀察融合蛋白的情況,這比熒光蛋白更為便捷。此外,OA片段表達(dá)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量明顯小于GFP(26.9×103)和GST,這可能有利于降低標(biāo)簽蛋白對目的蛋白的影響,至少不影響對目的蛋白的Western blot鑒定。然而,在后續(xù)研究目標(biāo)蛋白功能時,融合蛋白的可視化標(biāo)簽(Cyt-b5片段)是否需要切除,蛋白標(biāo)簽的切除與否對目的蛋白的功能是否存在影響,以及是否需要添加便于切割的標(biāo)簽序列等系列問題,仍需進(jìn)一步研究。