溫承坤，李琴，蔡開云，陳萍，郭婷婷，陳茂彬*

1(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢，430068)2(湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北 武漢，430068)3(湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司，湖北 宜昌，443000)

21世紀(jì)是科學(xué)創(chuàng)新的時(shí)代，如何利用科學(xué)創(chuàng)新實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的理念，成為人們思考的問題。木質(zhì)纖維素被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)燃料乙醇、制漿造紙、動(dòng)物添加飼料及制藥工業(yè)用的生物活性酚等方面，隨之而來的是生產(chǎn)原料逐步減少的問題，因此利用生物方法高效利用可再生木質(zhì)纖維素，將其轉(zhuǎn)化為低分子質(zhì)量的碳源，成為當(dāng)前關(guān)鍵要點(diǎn)[1]。由于植物細(xì)胞壁呈交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，需要一系列纖維素酶和半纖維素酶的協(xié)同作用來降解。因此，阿魏酸酯酶在水解羧酸的過程中具有重要的作用，由于植物細(xì)胞壁內(nèi)的羥基肉桂酸和糖之間存在不易降解的酯鍵，因此需要阿魏酸酯酶的作用來切斷相連的酯鍵，促進(jìn)其他酶類物質(zhì)和植物細(xì)胞壁結(jié)合，最后作用于木質(zhì)纖維素，達(dá)到釋放羧酸的目的[2]。此外，研究表明，阿魏酸酯酶還具有許多其他生物技術(shù)功能，如生產(chǎn)燃料乙醇、制漿造紙、添加動(dòng)物飼料、合成保健和制藥工業(yè)用的生物活性酚組分等。

1 阿魏酸酯酶簡介

阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是一種廣泛分布于果蔬表皮或根部，谷物麩皮等部位的酚酸[3]。天然阿魏酸主要與糖、脂類、多胺和蛋白質(zhì)多糖結(jié)合存在[4]。阿魏酸作為一種功能物質(zhì)，具有多種生理功能，如抑菌消炎等作用。吸收的阿魏酸在肝臟中代謝，其中大部分(60%～90%)轉(zhuǎn)化為共軛形式(阿魏酸硫葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸苷)，并在尿液中排出[5-7]；同時(shí)，阿魏酸是一種天然抗氧化活性成分，能去除機(jī)體內(nèi)的自由基，達(dá)到延緩衰老的作用[8]；阿魏酸通過抑制肝臟中膽固醇合成，來預(yù)防冠心病[9]；與此同時(shí)，阿魏酸具有低毒性，經(jīng)監(jiān)測分析，雄鼠LD50=2 445 mg/kg；雌鼠LD50=2 113 mg/kg，因此可作為保鮮劑、抗氧化劑應(yīng)用于食品中，日本現(xiàn)已將其列為食品添加劑添加至食品中起抗氧化作用[10]。

木質(zhì)纖維素是一種可再生材料，無毒害，且無放射性，已被普遍應(yīng)用。但如何利用生物新技術(shù)進(jìn)行有效利用可再生木質(zhì)纖維素成為研究熱點(diǎn)。而關(guān)鍵技術(shù)在于破解植物細(xì)胞壁內(nèi)部的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此，需要阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase，F(xiàn)AE)來打破如何破解網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的障礙，阿魏酸酯酶是一種羧酸水解酶，可以破壞這種結(jié)構(gòu)，加快纖維素的降解[11]，幫助釋放多種抗氧化物質(zhì)，并在食品、生產(chǎn)生物乙醇、化妝品、醫(yī)藥、造紙等領(lǐng)域廣泛使用[11-12]。文章圍繞著阿魏酸酯酶的來源、獲取、作用、分子結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)應(yīng)用及發(fā)展?jié)摿Ψ矫妫瑢Π⑽核狨ッ高M(jìn)行綜述。

2 阿魏酸酯酶來源

在阿魏酸酯酶的相關(guān)研究中，自初次發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶[13]以來，隨著對阿魏酸酯酶研究的深入，發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶被認(rèn)為是許多微生物半纖維分解酶系統(tǒng)的常見成分。并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)在植物、動(dòng)物、微生物中均能產(chǎn)生阿魏酸酯酶。由此可見，自然界中FAE的來源分布較為廣泛，于是可根據(jù)不同來源，將其劃分為微生物阿魏酸酯酶和植物阿魏酸酯酶兩種。

2.1 植物阿魏酸酯酶

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在麥芽等發(fā)芽谷物中均檢測到阿魏酸酯酶的活性，但是相關(guān)報(bào)道極少，與此同時(shí),關(guān)于阿魏酸酯酶在植物體內(nèi)存在的具體功能也非常少。劉莎莎等[14]對大麥粒和麥芽中阿魏酸酯酶活性進(jìn)行檢測，首次發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶的活性，且阿魏酸酯酶活性在大麥培養(yǎng)溫度為25 ℃，發(fā)芽2 d后處于最高，于是推斷出這種酶可能對大麥的發(fā)芽過程產(chǎn)生影響。LATHA等[15]從發(fā)芽的龍爪稷中，經(jīng)過分離純化也得到了一個(gè)分子質(zhì)量為79.4 kDa的阿魏酸酯酶，含4個(gè)亞基。

2.2 微生物阿魏酸酯酶

1991年媒體報(bào)道首次得到純化的阿魏酸酯酶[16]。伴隨著科學(xué)技術(shù)迭代跟新，阿魏酸酯酶的研究方法不斷更替，故30多個(gè)阿魏酸酯酶被純化并從幾種微生物中進(jìn)行表征，如嗜酸乳桿菌、索氏青霉菌、嗜皮諾青霉菌等，純化后的阿魏酸酯酶在分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和最佳水解反應(yīng)條件等物理特性方面表現(xiàn)出顯著的變化。分子質(zhì)量為11～210 kDa，等電點(diǎn)為3～9.9。阿魏酸酯酶的物理化學(xué)特性與其最佳反應(yīng)條件之間沒有相關(guān)性。微生物阿魏酸酯酶具有廣泛的pH值和溫度依賴性，最佳活性出現(xiàn)在pH值4～8和30～65.8 ℃。綜合眾多研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶能通過絲狀真菌和細(xì)菌的胞外分泌獲取，值得注意的是，曲霉屬的絲狀真菌在能夠產(chǎn)阿魏酸酯酶的微生物中占1/3。

2.2.1 真菌阿魏酸酯酶

真菌的培養(yǎng)基質(zhì)是影響真菌產(chǎn)阿魏酸酯酶的主要因素。自然界中，由于大部分真菌生長于一些枯枝和草木的莖干上，故當(dāng)培養(yǎng)基質(zhì)中存在著木質(zhì)纖維素類物質(zhì)時(shí)，阿魏酸酯酶才能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生，這也是因?yàn)榘⑽核狨ッ缸鳛橐环N誘導(dǎo)酶，存在著特殊的誘導(dǎo)機(jī)制所決定的。因此，一旦培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)生改變，部分真菌則無法誘導(dǎo)產(chǎn)生阿魏酸酯酶，與此同時(shí)，不同種類的真菌所需要的培養(yǎng)基質(zhì)也不相同[17]。在現(xiàn)有的研究中，已經(jīng)分離純化出6種阿魏酸酯酶，它們分別是FAE-Ⅰ，F(xiàn)AE-Ⅱ，AnFaeA，AnFaeB，F(xiàn)AE-1和FAE-2，且這6種酯酶的理化性質(zhì)和作用基質(zhì)均不相同，其中堿性阿魏酸酯酶為FAE-1和FAE-2[18]。由此可知，不同來源的阿魏酸酯酶最適反應(yīng)溫度、pH等相關(guān)性質(zhì)各不相同。其中，Neocallimastix MC為現(xiàn)有研究中能夠產(chǎn)生最小分子質(zhì)量阿魏酸酯酶的真菌，所產(chǎn)分子質(zhì)量為11 kDa[19]。盡管同一株真菌能分離出具有相同最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH等理化性質(zhì)的阿魏酸酯酶，但在底物特異性方面存在著較大差異，同時(shí)它們對木質(zhì)纖維素的降解作用具有一定的差異性。

2.2.2 細(xì)菌阿魏酸酯酶

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，在動(dòng)物及人類的腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)存在阿魏酸酯酶，此外還有一部分阿魏酸脂酶來源于植物致病菌和瘤胃細(xì)菌。這一類阿魏酸酯酶能夠幫助吸收從膳食纖維中釋放出來的游離阿魏酸，實(shí)現(xiàn)乳酸菌的抗氧化性作用。COUTEAU等[20]在人體排泄物中分離出35種細(xì)菌，并對它們進(jìn)行阿魏酸酯酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)有6種細(xì)菌具有阿魏酸酯酶活性，并且證實(shí)了腸道中細(xì)菌能夠?qū)⑸攀忱w維中游離阿魏酸釋放出來，且有助于人體健康。ABEIJN MUKDSI等[21]對小鼠進(jìn)行投喂實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攝入奶酪的小鼠抗氧化性明顯高于對照組小鼠，其中血漿中硫代巴比妥酸降低2倍，谷胱甘肽還原酶升高5倍，因此說明了乳酸菌產(chǎn)生的阿魏酸酯酶能幫助阿魏酸等抗氧化物質(zhì)在腸道中得到充分利用。LI等[22]克隆出FAEⅠ、FAEⅡ和FAEⅢ三種阿魏酸酯酶，并且對這3種阿魏酸酯酶的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3種酶最適作用溫度在40 ℃，最佳pH分別為6.0～7.0、8.0和9.0，通過分析，猜測出Fae Ⅰ和而Fae Ⅱ兩種阿魏酸酯酶在木質(zhì)纖維素降解中的協(xié)同作用機(jī)制：首先前者松開天然纖維素結(jié)構(gòu)，將纖維素暴露出來，然后被降解成小分子酚酸-糖酯；后者酶與小分子底物有很高的親和力，能夠快速降解進(jìn)入細(xì)胞的底物。

3 阿魏酸酯酶的生產(chǎn)

在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的過程中，固態(tài)發(fā)酵法和液體發(fā)酵法是目前最主要的兩種發(fā)酵方法，其中固態(tài)發(fā)酵[23]原料主要采用工農(nóng)業(yè)副、廢產(chǎn)品，如麩皮、薯粉、玉米粉和高粱等一類具有經(jīng)濟(jì)易得、富含營養(yǎng)物質(zhì)作用的物質(zhì)。所以固態(tài)發(fā)酵法具有發(fā)酵周期短、能耗少、耗水量低，對環(huán)境污染程度低等諸多優(yōu)勢，相比于復(fù)雜的液態(tài)發(fā)酵過程，固態(tài)發(fā)酵是目前生產(chǎn)阿魏酸酯酶的主要選擇。因?yàn)樾←滬熎ぜ?xì)胞壁中的物質(zhì)在阿拉伯糖和阿魏酸等橋鏈作用下，細(xì)胞壁形成不易被降解的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如果要實(shí)現(xiàn)阿魏酸的高效釋放，則需要阿魏酸酯酶、纖維素酶和木聚糖酶3種酶共同作用，通過破壞結(jié)構(gòu)緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，達(dá)到降低纖維素間的阻礙作用。

當(dāng)生產(chǎn)阿魏酸酯酶采用固態(tài)發(fā)酵法時(shí)，要求發(fā)酵基質(zhì)中存在淀粉基和纖維素基，如玉米麩和燕麥木聚糖等。所以將發(fā)酵底物基質(zhì)的理化性質(zhì)[24]作為影響微生物發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸的主要因子。為了比對不同因素對阿魏酸釋放的影響程度，SAMAD等[25]利用枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，添加至香蕉莖稈廢物中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并采用共培養(yǎng)的方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH值、料液比、共培養(yǎng)類型，接種量，攪拌5種因素對阿魏酸的產(chǎn)量具有比較明顯的影響，其中pH值因素的影響最大，料液比因素影響最小。SAMAD等[25]使用脫淀粉麥麩和麥麩作為兩種不同的發(fā)酵底物。結(jié)果表明，麥麩酶產(chǎn)量最高，是去淀粉麥麩的2倍，故可認(rèn)為誘導(dǎo)FAE產(chǎn)生的主要因素為阿魏酸酯鍵。

4 分子結(jié)構(gòu)解析

FAE作用的底物結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，大部分阿魏酸酯酶整體呈現(xiàn)為結(jié)構(gòu)緊湊的球蛋白，并由多個(gè)α螺旋包圍多個(gè)連續(xù)的β折疊片，從而形成典型α/β水解酶結(jié)構(gòu)[26]。與此同時(shí)，在活性中心均存在由“絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸(Ser-His-Asp)”構(gòu)成的典型催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，但對于來自不同類型的FAE，它們之間的空間結(jié)構(gòu)也各不相同。例如，A類阿魏酸酯酶來源于黑曲霉，5個(gè)α螺旋和2個(gè)β折疊片將在FAE-Ⅲ中心存在的9個(gè)相連β折疊片包圍起來[27](圖1)。

圖1 阿魏酸酯酶 A(FAE-Ⅲ)的拓?fù)淇臻g結(jié)構(gòu)

SAMAD等[25]研究發(fā)現(xiàn)，A、B、C、D這4種不一樣的阿魏酸酯酶，它們之間保守序列和基因序列各不相同，由此可證實(shí)酯酶基因序列所在的保守序列可能與其底物的異同性存在關(guān)聯(lián)。在A型阿魏酸酯酶典型的GHSLG形式的保守序列中，Ser、Asp、His共同構(gòu)成了阿魏酸酯酶的三聯(lián)體催化活性中心，即Ser133-Asp194-His246[28]。另外，在FAE-Ⅲ的活性位點(diǎn)，存在一個(gè)環(huán)狀殘基和一個(gè)蓋狀區(qū)域，其中，環(huán)狀殘基的調(diào)整性可以促進(jìn)底物結(jié)合，蓋狀區(qū)域決定底物的特異性，而在FAE序列中，特殊的N-糖基化位點(diǎn)使活性位點(diǎn)保持開放型構(gòu)象的狀態(tài)。當(dāng)催化反應(yīng)開始時(shí)，阿魏酸酯酶的催化中心和輔助中心共同束縛底物中的阿魏酸殘基，并經(jīng)過一系類化學(xué)反應(yīng)使酯鍵斷裂，游離出阿魏酸。

5 阿魏酸酯酶的應(yīng)用現(xiàn)狀

5.1 合成酚酸類化合物

由于這一類酚酸物質(zhì)具有抑菌、抗腫瘤、防紫外線、抗氧化等作用，所以FAE廣泛應(yīng)用于多種行業(yè)中。然而，由于這些酚酸分子含有雙鍵，且烷烴相對較短，增加了親水性，削弱了脂肪的溶解性，從而影響其在人體的運(yùn)輸和利用，所以在很大程度上應(yīng)用于油性食品和化妝品。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A以酯鍵的形式與糖、醇或脂質(zhì)基質(zhì)結(jié)合，可顯著提高阿魏酸的脂溶性，增加其穩(wěn)定性。

5.2 生物加工

阿魏酸酯酶作為完成木質(zhì)纖維素水解必需輔助酶，被有效應(yīng)用于生成生物乙醇等產(chǎn)品。將阿魏酸酯酶與其他水解酶和氧化酶聯(lián)合使用，能夠顯著促進(jìn)植物材料的分解，提高可發(fā)酵碳水化合物的利用率并釋放出酚類和有毒的酯類化合物，從而抑制預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料的發(fā)酵過程[29]?；诖?，部分研究者嘗試通過構(gòu)建基于阿魏酸酯酶與其他酶類的融合蛋白，來提高催化效率或底物親和力[30-31]。工業(yè)生產(chǎn)過程中使用的酶除了要求有高的催化活性，還必須能耐受極端條件，如高溫。許多課題組為了改善阿魏酸酯酶的耐熱性，采用了不同的策略構(gòu)建了多種阿魏酸酯酶突變體，使其可以耐受生物過程中的高溫[32-33]。

5.3 食品及醫(yī)藥領(lǐng)域

阿魏酸和其他羥基肉桂酸是酚類植物性化學(xué)物質(zhì)，其獨(dú)特和有效的特性可作為抗氧化劑[34]、防曬因子[35]、脫色素劑等[36]被廣泛用于食品及化妝品行業(yè)。阿魏酸等羥基肉桂酸可作為VC和VE的載體，使皮膚光防護(hù)增強(qiáng)，同時(shí)由于親脂性更強(qiáng)，從而能更好地滲透到角質(zhì)層[37]。同時(shí)，它們還具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗血栓等多種藥效及保健功能[38]。

FAE-A可以有效增加小鼠血清中IFN-y、IL-4和IgG的含量，證實(shí)FA具有促進(jìn)小鼠免疫功能的作用[39]。使用低聚糖阿魏酸酯可升高大鼠血清胰島素水平，并降低血糖值，且不受大鼠是否懷孕的影響[40]。但部分研究表明，在血糖代謝方面，玉米皮低聚糖阿魏酸酯只對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠表現(xiàn)出降低血糖的作用，對健康大鼠無明顯降血糖的效果。在腸道微生態(tài)方面，玉米皮低聚糖阿魏酸酯能夠調(diào)節(jié)糖尿病相關(guān)菌群豐度，有效增加腸道菌群豐度及多樣性，同時(shí)還能明顯提升大鼠腸道中短脂肪酸的含量[41]。

5.4 制漿造紙工業(yè)

在制漿造紙工業(yè)中，為了生產(chǎn)出高品質(zhì)紙張，工廠往往在傳統(tǒng)的制漿造紙過程中，使用氯化物來去除易使紙漿呈黑色的木質(zhì)素來獲得高質(zhì)量的紙漿，但去除的過程中產(chǎn)生含有大量芳香族有毒污染物的廢水，并對環(huán)境造成嚴(yán)重污染，違背可持續(xù)發(fā)展觀念。因此，企業(yè)生產(chǎn)尋求氯化物替代品，以期達(dá)到環(huán)保的目的。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸酯酶能夠水解植物細(xì)胞壁間連接的木質(zhì)素和碳水化合物的阿魏酸酯鍵，故阿魏酸酯酶作為一種去除木質(zhì)素替代物被廣泛應(yīng)用于各類企業(yè)中。

5.5 飼料工業(yè)

在飼料工業(yè)中，纖維消化率是決定動(dòng)物飼料品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。低纖維消化率易導(dǎo)致動(dòng)物消化不良，進(jìn)而阻礙生物生長，誘發(fā)免疫應(yīng)激反應(yīng)，降低飼料轉(zhuǎn)化率，最終降低養(yǎng)殖收益率。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸和羥基肉桂酸對動(dòng)物自身健康有益[42],但植物細(xì)胞壁成分的阿魏酸化是反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)的主要抑制因素之一。在飼料中添加阿魏酸酯酶可以加速植物細(xì)胞壁成分的降解，提高植物營養(yǎng)素的纖維消化，同時(shí)還能提高動(dòng)物對飼料的消化率，促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育[43]。

6 結(jié)論

本文綜述了現(xiàn)階段阿魏酸酯酶相關(guān)研究，利用阿魏酸酯酶研發(fā)人畜食品、醫(yī)藥、造紙、生物燃料與飼料等產(chǎn)品成為當(dāng)下熱點(diǎn)，由于當(dāng)前所獲得的阿魏酸酯酶存在不穩(wěn)定性的問題，因此需要研究者利用現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)，如檢測分析技術(shù)，對阿魏酸酯酶的活性進(jìn)行測定和定量等，同時(shí)通過對阿魏酸酯酶進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)獲取更多產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株，并結(jié)合現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)使其在植物、細(xì)菌等不同體系中進(jìn)行高效穩(wěn)定表達(dá)，最終提高阿魏酸酯酶在各類領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。同樣利用現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)，開發(fā)出阿魏酸酯酶更多不同的功能，進(jìn)而拓寬阿魏酸酯酶在生產(chǎn)生活的利用范圍。除此之外，根據(jù)當(dāng)前眾多研究分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AE中最保守的就是Ser-Asp-His三點(diǎn)催化活性中心，且催化能力與His、Ser的構(gòu)型密切相關(guān)，于是在接下來關(guān)于阿魏酸酯酶的研究中，研究者應(yīng)該著重于如何利用阿魏酸酯酶三點(diǎn)催化活性中心的結(jié)構(gòu)特性，來提高阿魏酸酯酶的活性和穩(wěn)定性，這將成為研究者接下來的重點(diǎn)關(guān)注及研究方向之一。