王 強(qiáng),岑曉霞,溫興鑄,李 偉,張 偉

(海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院普外三科,上海 200003)

當(dāng)前，減重手術(shù)治療肥胖及相關(guān)并發(fā)癥療效確切且安全，但隨著手術(shù)數(shù)量的增加，越來(lái)越多的臨床證據(jù)表明，減重術(shù)后骨健康狀態(tài)會(huì)出現(xiàn)變化[1-3]，主要表現(xiàn)術(shù)后隨著顯著的生化、激素和機(jī)械應(yīng)力的改變可能明顯提升骨折風(fēng)險(xiǎn)。袖狀胃切除術(shù)(sleeve gastrectomy,SG)已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)際上最流行的減重手術(shù)，目前雖有臨床數(shù)據(jù)提示SG術(shù)后骨健康狀態(tài)惡化[3]，但關(guān)于SG術(shù)后骨健康狀態(tài)變化和機(jī)制研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尚較欠缺。本研究以肥胖SD大鼠為模型，初步探討SG術(shù)后對(duì)大鼠骨折風(fēng)險(xiǎn)升高的主要表現(xiàn)以及可能的機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

本研究共采購(gòu)6周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0003，動(dòng)物倫理申請(qǐng)?zhí)枺?0175001126]。

構(gòu)建肥胖大鼠模型：將40只SD大鼠隨機(jī)分成高脂飼料組(30只)和普通飼料組(10只)。高脂飼料組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，兩組同時(shí)喂養(yǎng)8周后，高脂飼料組中體質(zhì)量超過(guò)對(duì)照組平均體質(zhì)量120%的大鼠定為飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠，最終共26只大鼠誘導(dǎo)成功。

26只肥胖大鼠再次隨機(jī)分為肥胖組(10只)，SG組(16只)。SG組大鼠施行SG術(shù)，共6只大鼠在術(shù)后圍手術(shù)期死亡。故最終進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的三組：空白對(duì)照組(原普通飼料組)，肥胖組(肥胖大鼠)，SG組(肥胖大鼠+SG術(shù))，各10只。

2 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠均術(shù)前24h禁食，術(shù)前10h禁水。嚴(yán)格稱重后采用10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉。

SG組：大鼠充分麻醉待檢查疼痛反射及角膜反射消失后，取仰臥位固定于操作臺(tái)上。備皮、常規(guī)消毒、鋪無(wú)菌洞巾、換無(wú)菌手套。取腹部正中長(zhǎng)2～2.5cm切口，以劍突下2～3cm為宜。進(jìn)腹后以鹽水紗布縫蓋切口。用無(wú)菌醫(yī)用棉簽輕柔地牽拉開肝臟，以暴露大鼠胃。無(wú)損傷鑷子將胃從腹腔中游離出，離斷肝胃韌帶及胃脾韌帶，5-0絲線結(jié)扎、離斷朝向脾門的胃短血管和幽門旁的胃網(wǎng)膜血管。用無(wú)損傷腸鉗在胃大彎處夾閉，距幽門部3～5mm起向賁門his角下沿腸鉗切除整個(gè)胃底和3/4胃體。鹽水棉簽清理殘胃后用5-0可吸收縫線連續(xù)縫合胃切緣，出血處適當(dāng)以間斷縫合加固。檢查無(wú)活動(dòng)性出血，溫?zé)嵘睇}水沖洗腹腔2～3次后關(guān)腹。

大鼠術(shù)后立即予皮下注射葡萄糖生理鹽水20mL，常規(guī)禁食禁水24h，術(shù)后1～3d給予半流質(zhì)(氨素奶粉+少許飼料碎末攪拌而成)。術(shù)后第7天恢復(fù)各組術(shù)前飲食(不限量)，術(shù)后第2周開始分別計(jì)算各組大鼠每周平均日進(jìn)食量;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物均通過(guò)10%水合氯醛過(guò)劑量麻醉行安樂死。

3 觀察以及檢測(cè)指標(biāo)

(1)術(shù)前1d及術(shù)后8周每天定時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量；術(shù)后第2周起每天記錄每只大鼠的攝食總量，計(jì)算每周日均攝食量。(2)術(shù)后8周通過(guò)ELISA法測(cè)定三組大鼠血清血鈣、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)和25-羥基維生素D3[25(OH)D3]，以上試劑盒均由上海研謹(jǐn)生物公司提供。(3)術(shù)后8周通過(guò)雙能X線骨密度儀測(cè)定右側(cè)股骨以及脊柱的骨密度(bone mineral density，BMD)。(4)術(shù)后8周通過(guò)ELISA法測(cè)定三組大鼠血清骨代謝相關(guān)指標(biāo)：I型膠原蛋白C端末端肽(C-tenninal cross linked peptide，CTX)、I型前膠原氨基端前肽(Procollagen type ⅠN-terminal propeptide，PINP)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5a(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP-5a)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP-5b)，以上試劑盒均由上海研謹(jǐn)生物公司提供 。(5)術(shù)后8周處死大鼠，取右側(cè)股骨以及脛骨中上段，通過(guò)HE染色觀察骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨小梁以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。(6)通過(guò)取肥胖組和SG組脛骨中段骨髓組織石蠟包埋后HE染色，在高倍鏡下選取3個(gè)不連續(xù)的視野，人工計(jì)算脂肪細(xì)胞數(shù)量并取平均值進(jìn)行比較。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 體質(zhì)量以及攝食量的變化

空白對(duì)照組、肥胖組和SG組術(shù)前體質(zhì)量分別為(374.51±15.68)g、(487.30±13.70)g和(483.51±11.19)g，肥胖組與SG組體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SG組術(shù)后第1周體質(zhì)量迅速下降，最低體質(zhì)量出現(xiàn)在術(shù)后第8天(411.23±14.87)g，隨著術(shù)后不限量飲食的開放，SG組術(shù)后的體質(zhì)量再次緩慢上升。至術(shù)后第8周，三組的體質(zhì)量分別為(437.50±10.76)g、(550.78±10.76)g和(473.45±6.62)g。術(shù)后第1天至術(shù)后8周每日測(cè)定各組體質(zhì)量，SG組體質(zhì)量均顯著低于肥胖組(P<0.05)，提示SG手術(shù)干預(yù)成功。

三組術(shù)后第2周攝食量分別為(29.34±1.19)g、(32.11±0.94)g和(15.89±1.12)g，SG組顯著降低(P<0.05)。隨后SG組術(shù)后的攝食量緩慢增加，至術(shù)后第8周，三組的攝食量分別為(30.98±1.29)g、(32.17±1.17)g和(29.41±4.37)g，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2 BMD變化

雙能X線BMD儀測(cè)定結(jié)果提示肥胖組股骨和脊柱BMD較空白對(duì)照組大鼠顯著降低(P<0.05)，SG組術(shù)后大鼠的BMD進(jìn)一步降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1a、b。

3 骨組織學(xué)的變化

股骨HE染色(圖2a)，SG組較其他兩組骨小梁顯著變細(xì)，部分出現(xiàn)斷裂和穿孔，骨小梁間隔增寬和連接消失。同時(shí)部分大鼠股骨出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄，炎細(xì)胞浸潤(rùn)增加。肥胖組和SG組脛骨骨皮質(zhì)無(wú)顯著肉眼可見的差異，但SG組的骨小梁同樣顯著變細(xì)(圖2b)。

4 血鈣、PTH和25(OH)D3

術(shù)后8周空白對(duì)照組、肥胖組和SG組血鈣分別為(2.21±0.47)mmol/L、(2.33±0.59)mmol/L和(2.20±0.51)mmol/L，PTH各組分別為(32.85±4.18)ng/L、(34.55±6.42)ng/L和(35.01±8.91)ng/L，25(OH)D3分別為(18.21±3.95)μg/L、(18.58±4.44)μg/L和(19.34±6.73)μg/L，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)合SG后攝食量的結(jié)果，提示SG能有效控制體重，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是Ca吸收未造成顯著影響。

5 骨代謝指標(biāo)的變化

肥胖組和SG組CTX較空白對(duì)照組顯著升高，但肥胖組和SG組組間無(wú)差異(P>0.05)。圖1c。肥胖組和SG組的血清PINP亦較空白對(duì)照組顯著升高，但兩組組間無(wú)差異(P=0.09)。圖1d。肥胖組TRACP-5a較另外兩組顯著升高，SG組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1e)。SG組TRACP-5b顯著高于空白對(duì)照組，但與肥胖組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白對(duì)照組與肥胖組比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1f)。

6 骨髓脂肪細(xì)胞

肥胖組和SG組脛骨中段脂肪細(xì)胞數(shù)量分別為(11.2±2.8)個(gè)和(13.7±3.9)個(gè)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)(圖3)。

圖1 術(shù)后8周三組BMD、CTX、PINP、TRACP-5a和TRACP-5b比較(*P<0.05空白對(duì)照組 vs.肥胖組;@P<0.05空白對(duì)照組 vs.SG組;#P<0.05肥胖組vs.SG組)

圖2 術(shù)后8周股骨和脛骨HE染色(10×10)。a.三組右側(cè)股骨HE染色(10×10，SG組較其它兩組骨小梁顯著變細(xì)，部分出現(xiàn)斷裂和穿孔，同時(shí)部分大鼠股骨出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄，炎細(xì)胞浸潤(rùn)增加)；b.肥胖組和SG組脛骨HE染色(10×10，SG骨小梁顯著變細(xì)，部分出現(xiàn)斷裂和穿孔，炎細(xì)胞浸潤(rùn)增加)

圖3 術(shù)后8周肥胖組和SG組脛骨中段HE染色(10×40，黑箭頭所示為骨髓中的脂肪細(xì)胞)

討 論

2018年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織關(guān)于超重以及肥胖問(wèn)題的報(bào)道指出，超重和肥胖已成為一種全球性的“流行病”。SG術(shù)由于其確切的療效以及較少的并發(fā)癥已經(jīng)逐漸取代胃旁路手術(shù)，逐漸成為最流行的減重手術(shù)。已有報(bào)道指出SG術(shù)后會(huì)出現(xiàn)骨密度持續(xù)性降低和骨折風(fēng)險(xiǎn)的增加。本研究SG大鼠模型中發(fā)現(xiàn)SG可能導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)[1,3-5]升高，主要表現(xiàn)為大鼠股骨和脊柱的BMD顯著下降，股骨和脛骨的骨小梁破壞明顯，最初的理論常認(rèn)為是SG術(shù)后能量攝入的減少導(dǎo)致了骨健康的惡化。但在本研究中術(shù)后第2周即恢復(fù)SG組不限量的高脂飲食，至術(shù)后第8周的攝食量已與其他兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一方面，三組的血鈣、PTH以及25(OH)D3差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此不能以機(jī)體能量攝入和骨代謝原料[血鈣和25(OH)D3]的減少來(lái)解釋SG術(shù)后骨健康狀態(tài)的變化。

骨代謝生化指標(biāo)包括鈣磷代謝調(diào)節(jié)指標(biāo)、骨形成標(biāo)志物、骨吸收標(biāo)志物、激素與細(xì)胞因子。雖然骨代謝指標(biāo)不能作為診斷骨相關(guān)疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是常用于評(píng)價(jià)骨代謝狀態(tài)、預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)等。CTX是骨吸收的重要指標(biāo)，其升高程度與破骨細(xì)胞[6-7]活性增高相一致[8]。TRACP-5b作為第二代骨吸收標(biāo)志物，是一個(gè)有特異和高敏感的骨吸收指標(biāo)，主要來(lái)源于破骨細(xì)胞。CTX和TRACP-5b在骨質(zhì)疏松患者中明顯增高，對(duì)于骨折風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)具有主要的意義[7,9]。PINP是新骨形成的特異性敏感指標(biāo)，在兒童發(fā)育期、妊娠晚期、骨腫瘤和骨轉(zhuǎn)移等情況下會(huì)明顯升高。Ivaska等[6]報(bào)道19例糖尿病肥胖患者和27例非糖尿病肥胖患者行旁路手術(shù)和SG術(shù)，術(shù)后6個(gè)月檢測(cè)CTX、PINP和TRACP-5b等骨代謝指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)旁路手術(shù)和SG術(shù)后骨代謝指標(biāo)均明顯增高，同時(shí)在體重減輕后2型糖尿病緩解的患者中骨代謝指標(biāo)變化的更為顯著。本研究中CTX、PINP以及TRACP-5b的結(jié)果提示肥胖個(gè)體骨代謝指標(biāo)顯著活躍，主要表現(xiàn)在骨吸收和骨形成的平行增加，而以骨吸收升高更為明顯。由于檢測(cè)時(shí)點(diǎn)為體重已達(dá)平臺(tái)期，負(fù)重變化的影響可忽略。而SG術(shù)后增加能量攝入不可逆轉(zhuǎn)骨損害，提示SG術(shù)所造成的骨損害不單單與能量平衡狀態(tài)有關(guān)。

有研究指出SG術(shù)后造成顯著的腰椎和股骨干骨髓脂肪組織積聚，并與骨密度降低顯著相關(guān)[10]，這提示SG術(shù)后體脂肪減少和骨髓脂肪組織異常積聚的重分布現(xiàn)象可能與骨健康惡化相關(guān)。骨髓脂肪細(xì)胞(bone marrow adipose tissue,BMAT)在同時(shí)參與能量代謝和骨重塑形成過(guò)程中是橋接能量和骨代謝的媒介，主要可以分為結(jié)構(gòu)性BMAT(cBMAT)和調(diào)節(jié)性BMAT(rBMAT)，兩者在分布范圍及造血潛能方面截然不同[11-12]。因此在特殊的能量狀態(tài)下(如SG術(shù)后)可能會(huì)影響骨髓微環(huán)境的變化，并進(jìn)一步影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨化/脂化的種系分化走向，從而影響骨的代謝與更新。本研究初步分析了脛骨骨髓中的脂肪細(xì)胞個(gè)數(shù)，雖然SG組的脂肪細(xì)胞數(shù)較高脂組高，但并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析原因，一方面可能與實(shí)驗(yàn)時(shí)間以及樣本數(shù)量有關(guān)，另一方面可能與選取標(biāo)本的部位和采取計(jì)數(shù)方法的精密度不同有關(guān)。即便如此，研究結(jié)果提示了一個(gè)方向，即SG術(shù)后BMAT的變化是否是骨健康惡化的原因。進(jìn)一步精確的分析BMAT數(shù)量、超微結(jié)構(gòu)以及骨髓脂肪微環(huán)境的分子表達(dá)狀況，如脂環(huán)素、瘦素和脂類組學(xué)，可能更為精確地判斷SG術(shù)后骨髓脂肪細(xì)胞的變化，并對(duì)SG術(shù)后骨健康狀態(tài)變化做出更全面的解釋。