江雅平，徐國兵，劉 歐

（1.北京大學第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034；2.北京大學腫瘤醫(yī)院檢驗科，北京 100142；3.清華大學第一醫(yī)院檢驗科，北京 100016）

血清中尿酸（uric acid，UA）含量的測定可為痛風、腎臟疾病、心腦血管疾病[1]、糖尿病[2]、高血壓[3]、代謝綜合征[4]等多種疾病的診斷、治療和預后評估提供重要依據(jù)。因此，UA檢測結(jié)果的準確可靠對于臨床極其重要?；ネㄐ院玫臉藴饰镔|(zhì)是驗證常規(guī)檢測系統(tǒng)準確性的理想物質(zhì)。UA標準物質(zhì)有UA純度標準物質(zhì)SRM 913a、GBW 09202和血清基質(zhì)標準物質(zhì)SRM 909b、909c。純度標準物質(zhì)用于參考方法的定值，血清基質(zhì)標準物質(zhì)一般用于參考方法正確度的考察。SRM 913a、909b、909c和GBW 09202都為凍干粉末，這些物質(zhì)在常規(guī)檢測系統(tǒng)之間往往不具互通性，因此不能用于常規(guī)檢測系統(tǒng)的準確性評定。目前，尚沒有源于人體樣本或無基質(zhì)效應的UA標準物質(zhì)，與待測人體樣本具有相同基質(zhì)的標準物質(zhì)可用于UA常規(guī)檢測系統(tǒng)精度及正確度的評價。另外，國際標準物質(zhì)價格昂貴、購買和運輸受限，給我國UA測定的量值溯源帶來很大困難。本研究根據(jù)《標準物質(zhì)/標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[5]（簡稱ISO Guide 35）的要求，采用公認無基質(zhì)效應的新鮮冰凍人血清，研制了5個濃度的UA候選標準物質(zhì)，并對其進行了定值、均勻性、穩(wěn)定性、互通性考察，同時對定值結(jié)果進行了不確定度評價。

1 材料和方法

1.1 標準物質(zhì)的制備

收集乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒為陰性，無肉眼可見脂血、溶血和黃疸的5個UA濃度混合健康人血清，分別命名為C1、C2、C3、C4、C5，確保所研制的標準物質(zhì)的生物安全性符合要求。血清經(jīng)離心、粗濾后，用0.22 μm的硝酸纖維素膜過濾，充分混勻后分裝于1.8 mL凍存管中，0.5 mL/支，每個濃度1 000支，-70 ℃保存?；旌戏盅b全過程在無菌超凈臺進行。

1.2 主要儀器與試劑

硝酸纖維素膜（德國Sartorius公司）、帶蓋漏斗過濾器（美國Pall公司）、SHB-A型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城公司）、連續(xù)分配器（德國Brand公司）、凍存管（丹麥Nunc公司）。

1.3 方法

1.3.1 均勻性評價 按ISO Guide 35[5]要求，隨機抽取-70 ℃保存的C1～C5各10支（分別標號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10），每支重復測定3次，采用DXC 800全自動生化分析儀（美國Beckman-Coulter公司）由同一操作者在盡可能短的時間內(nèi)完成測量。測量順序：第1次，1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第2次，10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第3次，2-4-6-8-10-1-3-5-7-9。對檢測結(jié)果進行單因素方差分析，若P＞0.05，說明樣本間是均勻的。計算瓶間變異，瓶間均勻性的標準不確定度（ubb）計算公式為：

式中MSamong為組間均方，MSwithin為組內(nèi)均方，n為測定次數(shù)。樣品測定前，對DXC 800全自動生化分析儀進行校準后測定質(zhì)控品，質(zhì)控結(jié)果合格后再進行樣品測定。

1.3.2 穩(wěn)定性評價 隨機抽取一定量C1～C5，分別于室溫、4 ℃和-20 ℃放置，采用DXC 800全自動生化分析儀檢測，觀察其穩(wěn)定性。室溫和4 ℃放置的標本，分別于第1、2、3、6、7、9、11、14和15天測量UA。-20 ℃放置的標本分別于第1、6、12、19、27、42、65、93和115天測量UA。-70 ℃放置的標本，每個濃度每月隨機抽取1管測量UA。每管檢測2次，取均值。參照ISO Guide 35[5]要求，求出各溫度條件下各水平UA濃度與時間關系的直線回歸方程，對方程進行線性回歸方差分析以評估穩(wěn)定性。若P＞0.05，說明斜率的變化無統(tǒng)計學意義，UA結(jié)果不隨時間產(chǎn)生趨勢性變化，即所制備的冰凍血清物質(zhì)在此段時間內(nèi)是穩(wěn)定的。穩(wěn)定性對不確定度的評價包括長期不穩(wěn)定性的不確定度（ults）和短期不穩(wěn)定性的不確定度（usts）。usts主要考慮樣本通過運輸?shù)竭_使用者處過程中帶來的不穩(wěn)定性，若用干冰運輸，并在短時間內(nèi)到達，此時usts可以忽略，即usts=0。

1.3.3 定值 3家UA候選參考實驗室參與C1～C5的賦值，其中2家[北京大學第一醫(yī)院檢驗科和中生北控科技股份有限公司（簡稱中生北控）]用1993年日本臨床化學會推薦的以高氯酸去蛋白的反相高效液相色譜紫外檢測法（reversed-phase high performance liquid chromatography with ultraviolet detection，RPHPLC-UV）[6]為C1～C5賦值；另外1家為通過中國合格評定國家認可委員會ISO 17025和ISO 15195實驗室認可的實驗室[國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心（簡稱臨檢中心）]，采用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS）為C1～C5賦值。北京大學第一醫(yī)院檢驗科與中生北控都通過測量國際有證參考物質(zhì)SRM 909b和2008年的國際參考實驗室室間比對計劃（Ring Trials for Reference Laboratories，RELA）比對樣本，驗證了參考方法的準確性，且通過與臨檢中心建立的ID-LC/MS/MS進行比對[7]，以及參加2010年由國際臨床化學和檢驗醫(yī)學聯(lián)合會委托德國臨床化學協(xié)會組織的參考實驗室間UA RELA比對，進一步驗證了準確性。每個實驗室對C1～C5每天測量2次（分別在上午、下午進行），連續(xù)測量5 d，剔除離群值后，取全部結(jié)果的平均值為靶值。定值結(jié)果用“靶值±總不確定度（uCRM）”表示。每次定值測量中均測定有證標準物質(zhì)，保證測定結(jié)果的有效性。參照ISO Guide 35[5]，標準物質(zhì)的總不確定度（uCRM）是通過合成定值測量、均勻性和穩(wěn)定性對特征值不確定度的貢獻來評估的，計算公式為：

定值測量不確定度（uchar）主要為定值測定變異（s），取擴展因子k=2，計算公式為：

1.3.4 反復凍融 將C1～C5各取5份，-20 ℃保存，取出后室溫條件下解凍2 h，再放回-20 ℃保存2 h；再取C1～C5各4份，室溫解凍2 h，如此反復，使C1～C5均有反復凍融1～5次的標本。采用DXC 800全自動生化分析儀同時檢測上述標本UA。采用線性回歸分析C1～C5反復凍融1～5次對UA濃度的影響。

1.3.5 互通性 參照美國國家臨床實驗室標準委員會EP14-A2文件[8]，收集39份不同濃度的UA新鮮患者血清（100～856 μmol/L）。每份血清僅由3～5份患者的標本混合獲得，0.25 mL/支分裝于20支凍存管。將39份新鮮血清樣本和C1～C5于本實驗室建立的RP-HPLC-UV和15套生化檢測系統(tǒng)（表1）上測定2次UA，取均值，以RP-HPLC-UV法測量值為橫坐標，常規(guī)方法測量值為縱坐標，采用SPSS 22.0軟件計算15套生化檢測系統(tǒng)（常規(guī)方法）與RP-HPLC-UV方法的相關方程式、相關系數(shù)、斜率的95%可信區(qū)間；繪制新鮮患者血清在RP-HPLC-UV和幾種常規(guī)方法間的回歸直線及95%可信區(qū)間，觀察C1～C5的坐標點是否位于95%可信區(qū)間內(nèi)。如在，則表明C1～C5在該檢測系統(tǒng)的反應性與收集的新鮮患者血清相似，具有互通性。

表1 15套檢測系統(tǒng)的構(gòu)成

2 結(jié)果

2.1 均勻性

C1～C5均勻性檢驗的原始數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，單因素方差分析均顯示P＞0.05，說明C1～C5分裝后是均勻的。瓶間變異均＜1%。見表2。

2.2 穩(wěn)定性

線性回歸分析結(jié)果顯示,C1～C5室溫放置7 d和4 ℃放置9 d，UA濃度是穩(wěn)定的（P＞0.05），-20 ℃ UA濃度至少可穩(wěn)定115 d（P＞0.05）。C1～C5于-70 ℃可保存15個月，時間與濃度的直線回歸方程的斜率與0無差異（P＞0.05），表明濃度穩(wěn)定。見表3。

表2 C1～C5均勻性調(diào)查結(jié)果

表3 C1～C5 -70℃ UA濃度穩(wěn)定性調(diào)查結(jié)果 μmol/L

2.3 定值

C1～C5的靶值±uCRM分別為（70.00±3.12）、（281.67±4.69）、（383.00±6.46）、（431.00±9.95）和（520.00±12.10）μmol/L。見表4。

表4 C1～C5定值結(jié)果 μmol/L

2.4 反復凍融

線性回歸分析結(jié)果顯示，-20 ℃保存的C1～C5反復凍融1～5次，對UA濃度均無影響（P＞0.05）。見圖1。

2.5 互通性

39份人血清在15套生化檢測系統(tǒng)與HPLCUV方法間UA測定結(jié)果的相關性良好，相關系數(shù)均≥0.999，見表5。C1～C5 UA測定結(jié)果坐標點均在回歸直線95%可信區(qū)間內(nèi)，說明制備的C1～C5同人新鮮血清樣本基質(zhì)相似，在這些常規(guī)檢測系統(tǒng)上表現(xiàn)出良好的互通性。以Hitachi 7600系統(tǒng)為例，見圖2。

圖1 -20℃保存的C1～C5反復凍融1～5次UA濃度變化

表5 15套生化檢測系統(tǒng)與HPLC-UV方法的相關性和各方法C1～C5的檢測值

圖2 C1～C5在Hitachi 7600上與血清的反應性

3 討論

參考系統(tǒng)是醫(yī)學檢驗標準化的基礎，構(gòu)成參考系統(tǒng)最重要的2個要素是參考方法和參考物質(zhì)。與參考方法相比，參考物質(zhì)的使用更為簡單、快捷，在量值溯源和傳遞過程中起著非常關鍵的作用。互通性是指參考物質(zhì)在不同分析方法間具有與人體樣本相同的反應特性。具有互通性的參考物質(zhì)可以用于常規(guī)方法的校準。由于基質(zhì)效應，純度標準物質(zhì)在常規(guī)系統(tǒng)上往往不具有互通性。目前普遍使用的UA參考物質(zhì)為凍干品，凍干品在制備和使用過程中，分裝、凍干及復溶等會使整個溯源過程產(chǎn)生偏差。本研究制備的5水平UA冰凍混合人血清未使用處理過的材料或0.9%氯化鈉溶液進行稀釋，保證了在標準化過程中所有參考物質(zhì)與天然患者血清無差異，具有相同的基質(zhì)。通過15個月的觀察，UA -70 ℃保存具有良好的穩(wěn)定性，液體血清由于避免了因凍干、復溶等導致的誤差，因此瓶間變異小，精密度較高，且使用方便。

本研究調(diào)查C1～C5互通性的同時，還調(diào)查了11份商品化的校準液和質(zhì)控品在常規(guī)系統(tǒng)中的互通性，包括Dade校準液（3個水平）、Beckman-Coulter校準液、中生校準液、Roche cfas.校準液，朗道質(zhì)控品（2個水平）和伯樂質(zhì)控品（3個水平）。采用與調(diào)查C1～C5互通性相同的方法，繪制RP-HPLC-UV與常規(guī)檢測系統(tǒng)測定39份人血清結(jié)果的回歸直線圖，觀察11份校準液和質(zhì)控品的坐標點是否在39份人血清回歸直線的95%可信區(qū)間內(nèi)。結(jié)果顯示，高值Dade校準液在Beckman-Coulter、Ortho-Vitros、Dade、Roche和Hitachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中均不具互通性，Beckman-Coulter校準液在Beckman-Coulter、Ortho-Vitros、Dade、Roche和Hitachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中均不具互通性，中生北控和Roche cfas.校準液互通性最好，在所調(diào)查的常規(guī)檢測系統(tǒng)中均具有互通性，高值朗道質(zhì)控品在Dade、Roche和Hitachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中不具互通性，高值伯樂質(zhì)控品在Dade、Roche和Hithachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中不具互通性，中值伯樂質(zhì)控品在Dade和Roche常規(guī)檢測系統(tǒng)中不具互通性。低值UA校準液或質(zhì)控品較高值UA有更好的互通性。本研究制備的UA濃度為70～520 μmol/L的冰凍混合人血清物質(zhì)在所納入的15套生化檢測系統(tǒng)中均有良好的互通性。

本研究應用制備的冰凍混合人血清評價了北京部分醫(yī)院Roche、Beckman-Coulter、Ortho、Hitachi 4個品牌共20套檢測系統(tǒng)（每個品牌5套檢測系統(tǒng)）的分析性能，結(jié)果表明，4個品牌的UA常規(guī)檢測系統(tǒng)的精密度、相對偏差以及總誤差均符合生物學變異的適宜標準（變異系數(shù)＜4.3%，偏移＜4.8%，總誤差＜11.9%）[9]，與MILLER等[10]的研究結(jié)果一致，提示UA常規(guī)檢測系統(tǒng)具有良好的分析性能和一致性。

理想條件下，標準物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性應采用參考方法進行評價，但參考方法運行困難，無法隨時開展，故本研究選用精密度較好的Beckman-Coulter DXC 800全自動生化分析儀測量UA。綜上，本研究成功制備了5個濃度的UA冰凍血清標準物質(zhì)，其均勻性和穩(wěn)定性良好，定值可靠，在常規(guī)檢測系統(tǒng)上具有互通性，可作為UA候選二級標準物質(zhì)用于UA常規(guī)檢測系統(tǒng)精密度及正確度的評價，也可作為商品化校準物及質(zhì)控物定值溯源的標準，進一步促進我國UA檢驗的標準化工作。