王瑤 劉廷 于洋 王欣 宋方英 楊玲玲

作者單位：1山東第一醫(yī)科大學附屬青島眼科醫(yī)院 266071；2山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）山東省眼科研究所 山東省眼科學重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地266071

細菌性角膜炎是嚴重威脅視力的常見致盲性眼病，金黃色葡萄球菌是細菌性角膜炎的常見致病菌[1，2]。金黃色葡萄球菌產生的多種酶和毒素會造成角膜基質層壞死、融解、變薄，嚴重者可發(fā)生角膜潰瘍穿孔，甚至眼內感染，最終眼球萎縮[3]。細菌性角膜炎常用環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星等廣譜抗生素進行治療。然而，隨著抗生素的廣泛使用，細菌的耐藥性問題已成為一個緊迫的全球醫(yī)療問題[4]。尋找具有抗菌活性的生物活性物質治療細菌性角膜炎可能是解決這一問題的新途徑。

鈍頂螺旋藻是一種生活在海洋和淡水中的顫藻科藍綠藻[5]。螺旋藻長期以來在許多國家被用作食品和營養(yǎng)補充劑[6]，并且已經證明其對人類食用是安全的[7]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)鈍頂螺旋藻具有抗炎[8]、抗氧化[9]、抗病毒[10]、輻射防護[11]、腎保護[12]等多種重要的生物活性，這些研究表明，螺旋藻可能為許多疾病提供新的治療方法。依據(jù)鈍頂螺旋藻已經報道的抗菌活性，我們推測螺旋藻多糖提取物（Polysaccharide extract from spirulina platensis，PSP）可能對角膜金黃色葡萄球菌感染具有治療作用。本研究中，我們制備了PSP滴眼液，并觀察PSP滴眼液對兔金黃色葡萄球菌角膜炎的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45只新西蘭大白兔購自中國山東青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司，體質量2.0～2.5 kg，所有動物實驗均經山東省眼科研究所倫理委員會批準，并依據(jù)《視力與眼科研究協(xié)會（ARVO）關于在眼科和視力研究中使用動物的聲明》進行。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻多糖提取液的制備 根據(jù)文獻[13]，從鈍頂螺旋藻中提取PSP。鈍頂螺旋藻干粉（青島海洋大學生命學院）在95%（體積/體積）乙醇中浸泡過夜，在80 ℃的NaOH（pH=10.0）溶液中浸泡4～6 h，然后離心并收集上清液。將溶液調節(jié)至pH=7.0，并在4 ℃下采用5%三氯乙酸（青島云山生物科技有限公司）沉淀過夜。離心后，再用5%三氯乙酸沉淀上清液3 h。離心懸浮液并在4 ℃下用乙醇沉淀上清液過夜（上清液和乙醇體積比為1∶5）以獲得PSP。所得PSP沉淀物用丙酮洗滌2次，在凍干機中凍干，溶解于0.9%氯化鈉溶液（青島華仁藥業(yè)有限公司）中，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。采用蒽酮-硫酸法測定螺旋藻多糖的含量，用0.9%氯化鈉溶液將PSP溶液調節(jié)至100 μg/ml。

1.2.2 金黃色葡萄球菌接種液的制備 以金黃色葡萄球菌ATCC25923為試驗菌（山東省眼科研究所病原生物學實驗室），37 ℃孵育過夜。在37 ℃的搖瓶培養(yǎng)箱中，分離出幾個菌落，接種于胰蛋白酶大豆湯中18～22 h。通過分光光度計（德國艾本德）測量OD 600 nm的細菌濃度，并將細菌懸浮液調整至最終濃度2×104菌落形成單位（Colony Forming Units，CFU）/mL。

1.2.3 模型的建立 45只新西蘭大白兔，分別腹腔注射氯胺酮10 mg/kg （福建古田藥業(yè)）和氯丙嗪50 mg/kg（上海禾豐制藥）麻醉，0.5%鹽酸丙美卡因溶液（美國愛爾凱因）眼部局部麻醉。每只兔右眼建立金黃色葡萄球菌性角膜炎模型。采用基質注射針將制備的金黃色葡萄球菌（ATCC25923）取5 μl注入到角膜基質中，約100個CFU。注射后8 h，將兔隨機分成基底對照組、0.9%氯化鈉溶液組和PSP組，每組15只?；讓φ战M作為基底對照，金黃色葡萄球菌注射8 h后，裂隙燈顯微鏡下照相后處死并鉆取角膜。0.9%氯化鈉溶液組和PSP組作為實驗眼在金黃色葡萄球菌注射8 h后分別給予0.9%氯化鈉溶液和PSP點眼治療，點眼治療時間為9 h：先是每15 min點眼1次，持續(xù)點眼5次后，改為每30 min點眼1次，持續(xù)點眼14次；最后一次點眼后1 h，對實驗眼進行裂隙燈顯微鏡檢查，并用熒光素鈉染色觀察角膜上皮缺損。

1.2.4 臨床指標評分檢查 實驗眼于治療后接受裂隙燈顯微鏡檢查，由同一眼科醫(yī)師盲評。通過眼分泌物、結膜水腫、前房積膿、角膜基質浸潤和角膜基質水腫這5個參數(shù)來評估角膜細菌感染的程度。觀察者以0～4的嚴重程度遞增量表給出每個參數(shù)，5個參數(shù)的總分被認為代表角膜感染的嚴重程度，研究的指標評分總分為20分，得分越高表明嚴重程度越高，計算各組總分值并進行數(shù)據(jù)分析。本研究所用裂隙燈顯微鏡檢查評分標準見表1。

1.2.5 角膜金黃色葡萄球菌載菌量 觀察結束后立即處死兔子，使用8.5 mm角膜環(huán)鉆從角膜中央鉆取角膜。鉆取的角膜使用滅菌緩沖液勻漿，按1∶10梯度稀釋到10-5，選取3個合適稀釋度的菌液吸出0.1 ml涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，37°培養(yǎng)24 h，行菌落計數(shù)。

1.2.6 組織病理學染色 每組隨機抽取3只實驗兔，眼球摘除后立即放入4%中性甲醛固定，固定24 h后梯度乙醇脫水，經二甲苯透明，石蠟包埋后行4 μm切片，眼球石蠟切片進行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察比較各組角膜、房角和虹膜中浸潤炎癥細胞的數(shù)量。

1.2.7 實時定量PCR檢測 每組隨機抽取3只實驗眼，8.5 mm環(huán)鉆鉆取角膜，使用Trizol法提取組織RNA。使用HiScript III RT SuperMix for qPCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）合成cDNA模板，行實時定量PCR檢測，擴增體系為10 μl。擴增程序為95 ℃預變性30 s，循環(huán)反應95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個循環(huán)。所用引物及其序列如下：白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的正向鏈為5'-GAACCTGCAGCAGAAAAACCA-3'，反向鏈為5'-GAGGCAGAGCCCATGAAATTC-3'；白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的正向鏈為5'-CCACAGTGGCAATGAAAATGA-3'（Foward），反向鏈為5'-ACCTGCCGGAAGCTCTTGTT-3'；腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的正向鏈為：5'-TGCTGCACTTCAGGGTGATC-3'，反向鏈為5'-CTTGCGGGTTTGCTACTACGT-3'；GAPDH的正向鏈為5'-CGCCTGGAGAAAGCTGCTAA-3'，反向鏈為5'-CCCCAGCATCGAAGGTAGAG-3'。

表1.角膜細菌感染裂隙燈顯微鏡評分標準Table 1.Slit lamp microscope scoring standards of keratitis

1.2.8 臺盼藍染色計數(shù)活細胞比率 人角膜上皮細胞（Human corneal epithelial cells，HCEC）由Choun-Ki Joo（韓國天主教大學）饋贈，使用D/F12+10%胎牛血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將細胞均勻接種于96孔板，每孔3×103個細胞。對照組和PSP組設置質量百分比濃度梯度分別為0.001%、0.005%、0.01%、0.02%和0.04%，每個濃度3個復孔。細胞貼壁培養(yǎng)24 h后，基底對照組更換正常培養(yǎng)基，PSP組分別加入含不同濃度PSP的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用0.04%臺盼藍對各組消化后的細胞進行染色計數(shù)（活細胞比例%=總細胞量100%-著色的死細胞量%）。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗研究。使用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料在組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裂隙燈顯微鏡檢查及臨床評分

兔角膜基質注射金黃色葡萄球菌8 h后，裂隙燈顯微鏡檢查見結膜囊內少量分泌物，伴結膜輕度充血水腫，角膜中央可見片狀浸潤灶，未見基質水腫和前房積膿，表現(xiàn)為病情較輕型細菌性角膜炎（見圖1）。0.9%氯化鈉溶液組和PSP組點眼治療9 h后，裂隙燈顯微鏡下觀察顯示，0.9%氯化鈉溶液組兔眼可見大量的分泌物，結膜見中到重度充血水腫，角膜見輕到中度基質浸潤，受累范圍為角膜的1/4～3/4，基質見水腫混濁，虹膜紋理可見或隱約可見，部分兔眼伴有前房積膿，呈現(xiàn)出病情較重型細菌性角膜炎；而PSP組用藥后兔角膜炎癥反應均有不同程度的改善，各項指標較0.9%氯化鈉溶液組均有不同程度的減輕，治療效果較為顯著，結膜囊分泌物及結膜、角膜、前房的炎癥反應等均有明顯的減輕（見圖1）。根據(jù)裂隙燈顯微鏡的觀察結果，對眼分泌物、結膜水腫、前房積膿、角膜基質浸潤和角膜基質水腫這5個參數(shù)進行評分以評估角膜細菌感染的程度，結果發(fā)現(xiàn)PSP組各方面臨床評分均優(yōu)于0.9%氯化鈉溶液組。PSP組和0.9%氯化鈉溶液組裂隙燈顯微鏡觀察臨床評分分別為4.58±1.56和9.50±2.81，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.293，P＜0.001）。

2.2 角膜上皮缺損情況

通過熒光素鈉染色對角膜金黃色葡萄球菌感染后的兔實驗眼進行了角膜上皮缺損的檢查，結果發(fā)現(xiàn)基底對照組角膜上皮可見輕微缺損，而0.9%氯化鈉溶液組角膜上皮缺損嚴重，PSP治療后角膜缺損面積較0.9%氯化鈉溶液組明顯減少（見圖2）。角膜上皮缺損面積分析顯示，0.9%氯化鈉溶液組角膜上皮缺損比例達（24.62±2.67）%，而PSP組上皮缺損比例僅為（8.07±3.62）%，由此可見，PSP治療后較0.9%氯化鈉溶液更能抑制金黃色葡萄球菌感染后兔角膜上皮的缺損（見圖3）。

圖1.裂隙燈顯微鏡下各組兔眼前節(jié)外觀圖A：基底對照組，兔角膜基質注射金黃色葡萄球菌8 h后，表現(xiàn)為病情較輕型細菌性角膜炎；B：0.9%氯化鈉溶液組，點眼治療9 h后，呈現(xiàn)出病情較重型細菌性角膜炎；C：螺旋藻多糖提取物組，點眼治療9 h后，癥狀類似基底對照組，表現(xiàn)為較輕型細菌性角膜炎Figure 1.The appearance of the anterior segment of the rabbit eye in each group was observed by slit lamp inspection.A:Basal control group:Eight hours after injection with Staphylococcus aureus in the rabbit corneal stroma,the cornea shows mild bacterial keratitis.B:0.9%sodium chloride solution group:Nine hours after topical treatment,the corneas show more severe bacterial keratitis.C:Polysaccharide extract from spirulina platensis group:Nine hours after topical treatment,the symptoms are similar to the basal control group,showing milder bacterial keratitis.

圖2.裂隙燈顯微鏡下點眼給藥治療后兔眼熒光素鈉染色角膜上皮缺損情況A：基底對照組（兔角膜基質注射金黃色葡萄球菌后8 h），上皮可見輕微缺損；B：0.9%氯化鈉溶液組（點眼治療9 h后），角膜上皮缺損嚴重，缺損范圍約為角膜1/4；C：螺旋藻多糖提取物組（點眼治療9 h后），角膜缺損面積明顯較0.9%氯化鈉溶液組少Figure 2.Slit lamp observation of rabbit corneal epithelial defect stained with sodium fluorescein after intraocular administration.A:In the basal control group (8 h after injection with staphylococcus),slight epithelial defects can be seen.B:In the 0.9% sodium chloride solution group(9 h after topical treatment),the corneal epithelial defect is severe,and the defect area is about 1/4 of the cornea.C:In the Polysaccharide extract from spirulina platensis group (9 h after topical treatment),the area of the corneal defect is significantly reduced when compared with 0.9% sodium chloride solution group.

2.3 兔角膜金黃色葡萄球菌細菌載量檢測

金黃色葡萄球菌細菌載量檢測顯示，0.9%氯化鈉溶液組與基底對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（t=1.303，P=0.2170），而PSP組角膜細菌載量明顯低于0.9%氯化鈉溶液組（t=4.383，P＜0.001）和基底對照組（t=3.508，P=0.004），差異均有統(tǒng)計學意義（見圖4）。

2.4 組織病理學比較

圖3.螺旋藻多糖提取物點眼給藥治療后兔角膜上皮缺損面積柱狀圖（每組15眼）與基底對照組（兔角膜基質注射金黃色葡萄球菌后8 h）比較，a P＜0.05；與0.9%氯化鈉溶液組比較，b P＜0.05Figure 3.Analysis of the rabbit corneal epithelial defect area after topical application of PSP (15 eyes in each group).After PSP treatment,compared with the 0.9% sodium chloride solution group,it can significantly inhibit the rabbit corneal epithelial defect after Staphylococcus aureus infection.PSP,polysaccharide extract from spirulina platensis.Compared with the basal control group (8 h after injection with Staphylococcus),a P＜0.05; compared with 0.9% sodium chloride solution group,b P＜0.05.

兔眼球組織病理學切片HE染色顯示，基底對照組可見局部角膜表層上皮缺損，角膜基質內偶見單個炎細胞浸潤，基質纖維排列整齊，房角和虹膜微血管輕度充血，前房角無明顯炎性細胞浸潤；0.9%氯化鈉溶液組角膜上皮層丟失，角膜基質水腫變性，大量炎性細胞浸潤，前房角內可見大量炎性滲出及炎癥細胞；虹膜血管擴張，表面可見炎性滲出膜；PSP組角膜上皮細胞局部缺損，角膜基質輕度水腫伴少量炎性細胞浸潤，房角未見明顯炎性滲出，可見少量炎性細胞浸潤，虹膜血管輕度擴張伴少量炎性細胞浸潤，見圖5。

2.5 PSP抑制炎癥因子表達的情況

圖4.治療后兔角膜細菌載量分析（每組15眼）與基底對照組（兔角膜基質注射金黃色葡萄球菌后8 h）比較，a P＜0.05；與0.9%氯化鈉溶液比較，b P＜0.05。PSP，螺旋藻多糖提取物Figure 4.Analysis of rabbit corneal bacterial load after treatment(15 eyes in each group).PSP,polysaccharide extract from spirulina platensis.Compared with the basal control group (8 h after injection with Staphylococcus),a P＜0.05;compared with 0.9% sodium chloride solution group,b P＜0.05.

圖5.螺旋藻多糖提取物點眼給藥治療后兔眼前節(jié)組織病理學變化比較螺旋藻多糖提取物組與0.9%氯化鈉溶液組比較，角膜上皮缺損及組織內炎癥細胞浸潤程度均明顯減輕Figure 5.Comparison of histopathological changes in the anterior segment of rabbit eyes after PSP treatment.Compared with the 0.9% sodium chloride solution group,corneal epithelial defects and infiltration of inflammatory cell tissue in the PSP group are obviously reduced.PSP,polysaccharide extract from spirulina platensis.

為進一步評價PSP對金黃色葡萄球菌感染后角膜炎癥的作用，本研究通過實時定量PCR檢測了各組常見炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平的表達情況，結果顯示PSP組角膜中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達均明顯低于0.9%氯化鈉溶液組，差異有統(tǒng)計學意義（IL-6：t=7.082，P=0.002；IL-1β：t=19.74，P＜0.001；TNF-α：t=8.092，P=0.001），見圖6。

2.6 PSP對人角膜上皮細胞存活率的影響

為評估PSP的安全性，本研究比較了不同濃度的PSP對體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞存活率的影響。人角膜上皮細胞在各濃度PSP中培養(yǎng)48 h后，臺盼藍染色計數(shù)結果顯示，活細胞均沒有明顯減少，活細胞比例較對照組未見明顯差異，見圖7。

3 討論

螺旋藻是一種光自養(yǎng)的原核生物，富含多種生物活性物質，營養(yǎng)價值高，廣泛應用于食品、藥品、保健品中，受到社會各界的研究和關注。存在于生物中的多糖是生命有機體的重要組成部分，與維持生命的多種生理功能相關，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)植物多糖具有多種生物活性，近年來，多糖良好的抗菌活性也受到關注。螺旋藻多糖是從螺旋藻提取的生理活性多糖，無毒，具有廣泛而復雜的生物活性，近年來受到各國學者的關注。越來越多的研究結果表明，螺旋藻多糖具有豐富的生理功能，包括抗衰老、抗氧化、抗病毒和抗炎活性等[8-10]。El-Sheekh等[14]研究證明鈍頂螺旋藻的提取物對廣譜細菌和真菌有效。Kaushik和Chauhan[15]發(fā)現(xiàn)鈍頂螺旋藻對包括金黃色葡萄球菌在內的革蘭氏陽性菌具有體外抗菌活性。Yang等[13]報道了PSP的局部應用具有抗血管生成和抗炎作用，可用于角膜新生血管的治療，說明PSP在眼科疾病中具有潛在的臨床應用價值。另有研究報道一些多糖具有潛在的抗菌活性[16]。但是，螺旋藻多糖對金黃色葡萄球菌引起的細菌性角膜炎的治療作用鮮見相關的研究報道。本研究在PSP安全性細胞實驗中設計了5個濃度，經過48 h細胞培養(yǎng)，證明了PSP對角膜上皮細胞的存活沒有明顯的影響。選用中間濃度0.01%進行體內實驗，首次發(fā)現(xiàn)螺旋藻多糖對金黃色葡萄球菌有良好的抗菌能力，在體實驗證明PSP能明顯減輕兔金黃色葡萄球菌性角膜炎嚴重程度，有良好的應用前景。

圖6.螺旋藻多糖提取物點眼給藥對角膜中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達的影響（每組15眼）與基底對照組（兔角膜基質注射金黃色葡萄球菌后8 h）比較，a P＜0.05；與0.9%的氯化鈉溶液比較，b P＜0.05Figure 6.The effects of PSP treatment on the expression of inflammatory factors IL-6,IL-1β,and TNF-α in the cornea (15 eyes in each group).Compared with the basal control group (8 h after injection with Staphylococcus),a P＜0.05; compared with 0.9% sodium chloride solution group,b P＜0.05.PSP,polysaccharide extract from spirulina platensis.

圖7.螺旋藻多糖提取物處理對角膜上皮細胞存活率的影響（每組15眼）各濃度PSP處理均不會引起角膜上皮細胞存活率下降Figure 7.The effect of PSP treatment on the ratio of viable corneal epithelial cells (15 eyes in each group).PSP treatments at various concentrations did not reduce the corneal epithelial cell viability.PSP,polysaccharide extract from spirulina platensis.

細菌性角膜炎是常見的眼部感染疾病，金黃色葡萄球菌是引起細菌性角膜潰瘍的常見病原菌。金黃色葡萄球菌是正常人結膜囊細菌培養(yǎng)的常見菌株，僅次于凝固酶陰性葡萄球菌[17，18]。金黃色葡萄球菌作為一種條件致病菌，可長期寄居在宿主表面，通常不會引起感染性疾病。本研究選用的是金黃色葡萄球菌ATCC25923，該菌通常是世界上許多國家細菌性角膜炎首位或第2位的致病菌。研究表明，來自患者結膜囊的細菌是引起結膜炎、角膜炎等常見眼部感染性疾病以及術后眼內炎的主要病因[19，20]，治療不當可導致永久性視力下降，甚至失明。目前針對細菌性角膜炎最有效的治療途徑是局部應用抗生素。但是抗生素容易誘導機體產生耐藥性，因此尋找安全有效的有抗菌活性的生物活性物質對預防和治療細菌性角膜炎非常重要，近年來受到各國學者的重視，但尚未有相關應用報道。

本研究通過觀察局部應用PSP對實驗性兔金黃色葡萄球菌性角膜炎的治療效果，首次在動物水平證實PSP治療能夠有效減輕金黃色葡萄球菌性角膜炎的臨床情況，表現(xiàn)為控制角膜上皮缺損，并降低分泌物、結膜水腫充血、前房積膿、基質浸潤、基質水腫等指標的臨床評分。為更好地了解PSP治療金黃色葡萄球菌性角膜炎的作用途徑及機制，我們進一步研究了它的抗菌和抗炎效果。通過菌落形成實驗，我們發(fā)現(xiàn)PSP能明顯降低感染金黃色葡萄球菌性角膜的菌落CFU，證明了PSP具有一定的抑制金黃色葡萄球菌的作用。類似于本研究，其他研究也在其他菌種中報道了螺旋藻多糖潛在的抗菌活性。Rajasekar等[21]研究發(fā)現(xiàn)從螺旋藻中分離的硫酸化多糖在圓盤擴散、瓊脂生物測定和蛋白質泄漏測定中顯示出對病原菌弧菌具有抗菌作用，并在100 μg/ml濃度時表現(xiàn)出最高的抗菌能力。這與本研究所使用的PSP濃度是一致的，也間接驗證了本研究的可靠性。本課題組之前的研究在角膜新生血管模型中驗證了PSP的抗炎作用[15]。Morsy等[22]研究也發(fā)現(xiàn)螺旋藻提取物對大鼠右旋糖酐硫酸鹽鈉誘導的潰瘍性結腸炎具有保護作用，能有效防止炎癥因子TNF-α、IL-6以及髓過氧化物酶的增高。通過組織病理學染色檢測，我們發(fā)現(xiàn)PSP點眼治療可以明顯減少金黃色葡萄球菌引起的角膜、房角及虹膜組織中的炎癥細胞浸潤；實時定量PCR結果顯示，PSP能顯著降低金黃色葡萄球菌引起的角膜組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，提示PSP具有對抗金黃色葡萄球菌引起的角膜炎癥的作用。

綜上所述，本研究報道了PSP對實驗性兔金黃色葡萄球菌性角膜炎的治療作用，這可能是通過PSP的抑菌和抗炎特性發(fā)揮作用的。本研究發(fā)現(xiàn)為應用PSP治療金黃色葡萄球菌性角膜炎的可行性提供了一定實驗依據(jù)，也為應用多糖類生物制劑治療細菌性角膜炎提供了新思路。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明王瑤：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。劉廷、于洋、王欣、宋方英：參與選題、設計和修改論文的結果、結論。楊玲玲：參與選題、設計、資料的分析和解釋；修改論文中關鍵性結果、結論；根據(jù)編輯部的修改意見進行核修