張小麗，海濤，劉文清，李非

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京100053

甲狀腺癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，其發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)［1］。甲狀腺癌常見的病理類型包括甲狀腺乳頭狀癌（PTC）、髓樣癌、未分化癌及濾泡狀癌。其中，PTC最為常見，約占所有病理類型的90%［2］。目前，甲狀腺癌的治療包括手術(shù)治療、促甲狀腺激素抑制治療、放射性碘治療及分子靶向治療等。但部分患者腫瘤惡性程度較高，易發(fā)生局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差［3］。因此，深入研究PTC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于尋找新的診斷及治療靶點(diǎn)，改善患者的預(yù)后，具有重要臨床價(jià)值［4］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）MIR31HG 基因位于染色體9p21.3，該基因編碼產(chǎn)生長(zhǎng)200～300 bp長(zhǎng)鏈非編碼RNA，能與多梳蛋白抑制復(fù)合體1結(jié)合，參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的分化、發(fā)育等生物學(xué)過程［5］。有研究報(bào)道，lncRNA MIR31HG 在肺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均存在表達(dá)異常升高的現(xiàn)象，其通過抑制下游腫瘤抑制因子p16 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展［6-7］。此外，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PTC 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MIR31HG 的表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B（AKT）的磷酸化，促進(jìn)PTC細(xì)胞的增殖和遷移［8］。本研究通過檢測(cè)PTC 組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG的表達(dá)，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2014 年 1 月—2015 年 1 月本院確診為 PTC 的患者 86 例，男 30 例，女性 56 例；年齡30～66（49.2 ± 6.5）歲；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 47 例；腫瘤直徑≤2 cm 38 例，>2 cm 48 例；伴局部浸潤(rùn)35 例，無(wú)局部浸潤(rùn)51 例；腫瘤TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期54例，Ⅲ、Ⅳ期32例?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：均為首次診治且經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為PTC；未接受放化療及免疫治療；臨床資料完整，患者及家屬對(duì)本研究知情同意并簽字。排除標(biāo)準(zhǔn)：PTC復(fù)發(fā)；合并PTC家族遺傳病病史、精神疾病病史；合并甲狀腺功能亢進(jìn)等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 PTC 及癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法。收集PTC患者經(jīng)甲狀腺全切或部分切術(shù)中新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣>2 cm，經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷），TRIzol 法抽提組織RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)組織RNA 的濃度。隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cD?NA。以 cDNA 為模板，進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix 10 μL、上游及下游引物各 0.5 μL、cDNA 模板 1 μL、ddH2O 8 μL。以U6 為內(nèi)參，用 2-ΔΔCt法計(jì)算組織中 lncRNA MIR31HG的相對(duì)表達(dá)量。U6 上游引物序列：5'-GATTATC?GGGACCATTCCACTG-3'，下游引物序列5'-GATCT?GGTTCCCAATGACTGTG-3'；lncRNA MIR31HG上游引物序列 5'-TTCTGTCCTCCTACTCGGACCC-3'，下游引物序列5'-TTCTGTCCTCCTACTCGGACCC-3'。

1.3 隨訪 對(duì)所有PTC患者自出院起開始隨訪，每半年進(jìn)行1次門診隨訪，記錄患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存情況，隨訪截至2020年2月或患者死亡，統(tǒng)計(jì)5年總體生存率（OS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；用 Kaplan-Meier生存曲線（Log-rank 檢驗(yàn)）分析PTC 患者預(yù)后；COX回歸分析PTC 患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC 及癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 表達(dá)比較 PTC 組織、癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 相對(duì)表達(dá)量分別為 1.472 ± 0.309、0.611± 0.123，PTC 組織中 lncRNA MIR31HG 相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織高（t=24.008，P<0.05）。

2.2 PTC 組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡患者PTC 組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期，腫瘤直徑>2 cm、局部浸潤(rùn)及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PTC 組織中l(wèi)n?cRNA MIR31HG 表達(dá)高于 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期，腫瘤直徑≤2 cm、無(wú)局部浸潤(rùn)及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P均<0.05）。見表1。

2.3 PTC 組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪2～60（38.2±5.5）個(gè)月，隨訪期間無(wú)失訪病例，死亡10例，存活76例，5年OS為88.3%（76/86）。以 PTC 組織中 lncRNA MIR31HG 表達(dá)的平均數(shù)1.468為界值，分為高表達(dá)組42例，低表達(dá)組44 例 。 lncRNA MIR31HG 高 表 達(dá) 組 5 年 OS 為78.6%（33/42），低表達(dá)組5 年OS 為97.7%（43/44）。高表達(dá)組 5 年 OS 低于低表達(dá)組（χ2=4.949，P<0.05）。

2.4 PTC患者預(yù)后的影響因素 lncRNA MIR31HG高表達(dá)、腫瘤TNM 分期高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PTC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表2。

表1 PTC組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系（-x± s）

3 討論

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，女性發(fā)病率較高。甲狀腺癌的病理類型中以PTC 最為常見。多數(shù)PTC 患者預(yù)后較好，但仍有少數(shù)患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等，甚至進(jìn)展為未分化型甲狀腺癌，危及患者生命［9］。因此，深入研究PTC 的發(fā)病及疾病進(jìn)展的機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的PTC 早期診斷指標(biāo)及治療藥物的研發(fā)。目前研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與遺傳因素、環(huán)境因素等有關(guān)，涉及癌基因的過度激活和抑癌基因的失活，多條信號(hào)傳導(dǎo)通路如絲裂原激活的蛋白激酶通路、AKT 通路的過度激活導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖、凋亡抑制及咋了血管生成增加，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［10］。腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路受到多種因素調(diào)控。非編碼RNA（ncRNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控基因表達(dá)的重要分子，在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、翻譯后修飾等各水平影響下游靶基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程［11］。

lncRNA 是長(zhǎng)度大于200 bp的ncRNA，以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因結(jié)核調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等過程，與感染、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病關(guān)系密切［12］。lncRNA MIR31HG 基因位于人類9號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)1 126個(gè)堿基，在結(jié)直腸癌、肝癌及膀胱癌等多種人類惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)升高的現(xiàn)象，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要致癌基因［13］。YAN 等［14］報(bào)道 lncRNA MIR31HG 的表達(dá)水平升高可結(jié)合并抑制miR-575 的表達(dá)，從而促進(jìn)致瘤樣因子7的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過度增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力增加。本研究表明，PTC 患者癌組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 表達(dá)明顯較癌旁正常組織升高，其機(jī)制可能與lncRNA MIR31HG 基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控有關(guān)。 研究表明，正常細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MIR31HG 基因啟動(dòng)子處于高甲基化的狀態(tài)；而腫瘤發(fā)生時(shí)，lncRNA MIR31HG 基因的甲基化轉(zhuǎn)移酶活性升高，導(dǎo)致lncRNA MIR31HG 基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化，促進(jìn)lncRNA MIR31HG基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤中 lncRNA MIR31HG 表達(dá)水平升高［15］。本研究中腫瘤分期高、腫瘤直徑>2 cm、伴局部浸潤(rùn)及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 表達(dá)水平較高，表明癌組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 的高表達(dá)促進(jìn)PTC 的發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道，腫瘤中l(wèi)ncRNA MIR31HG 可作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性 RNA 結(jié)合 miR-34a，促進(jìn)癌基因c-myc 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生惡性進(jìn)展［16］。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中亦研究表明，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC9 中l(wèi)n?cRNA MIR31HG的過表達(dá)能夠通過激活表皮生長(zhǎng)因子受體/AKT 途徑，抑制線粒體途徑凋亡，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展［17］。近年來(lái)有研究報(bào)道，腫瘤中l(wèi)ncRNA MIR31HG 的高表達(dá)與患者的不良生存預(yù)后有關(guān)，有可能成為新的腫瘤診斷治療靶點(diǎn)［18］。本研究中，lncRNA MIR31HG 高表達(dá)組 PTC患者的5 年OS 明顯較低，表明PTC 組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，因此檢測(cè)癌組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 的表達(dá)有可能成為判斷患者生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。本研究進(jìn)一步通過COX 回歸分析PTC 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，結(jié)果lncRNA MIR31HG 高表達(dá)、腫瘤TNM 分期高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PTC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，PTC組織中l(wèi)ncRNA MIR31HG 可能是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要腫瘤標(biāo)志物，有助于判斷PTC患者的預(yù)后。

表2 PTC患者預(yù)后不良危險(xiǎn)因素的Cox多因素分析

綜上所述，PTC 組織中 lncRNA MIR31HG 表達(dá)升高，與PTC 患者不良預(yù)后有關(guān)。 lncRNA MIR31HG 高表達(dá)、腫瘤TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響PTC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望成為新的判斷PTC患者生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。但限于本研究樣本例數(shù)有限，有待大樣本多中心研究進(jìn)一步研究lncRNA MIR31HG的臨床意義。