張冬梅，李寶麗

痹祺膠囊治療膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠的作用機(jī)制研究

張冬梅1，李寶麗2*

1. 天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院糖尿病科，天津 300131 2. 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 中醫(yī)科，天津 300052

探究痹祺膠囊對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠中軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）表達(dá)的影響。隨機(jī)選取10只SD大鼠作為對照組，其余大鼠建立CIA模型，CIA大鼠隨機(jī)分為模型組，痹祺膠囊中、高劑量（0.6、0.9 g/kg）組，甲氨蝶呤（1.67 mg/kg）組，連續(xù)給藥4周，觀察大鼠的一般情況和足腫脹變化，檢測大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達(dá)、軟骨中COMP mRNA表達(dá)。與對照組比較，模型組大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達(dá)、軟骨中COMP mRNA表達(dá)均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達(dá)、軟骨中COMP mRNA表達(dá)均顯著降低（＜0.001）。痹祺膠囊可能通過下調(diào)COMP表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨破壞，從而治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

痹祺膠囊；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白；膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎；滑膜

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，其病理特征為炎性細(xì)胞浸潤、關(guān)節(jié)滑膜增生，伴隨關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨進(jìn)行性損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，甚至出現(xiàn)畸形，因此RA的早期診斷治療至關(guān)重要[1-3]。膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）動物模型的臨床癥狀和病理表現(xiàn)與RA極為相似，為研究RA常用的動物模型。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，主要位于肌腱、軟骨和軟骨周組織。研究表明，COMP既能用于RA的早期診斷，又能用于判斷關(guān)節(jié)損傷情況[4]。本研究旨在探討痹祺膠囊對CIA大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達(dá)和軟骨中COMP mRNA表達(dá)的影響，為痹祺膠囊治療RA的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠50只，4周齡，體質(zhì)量（150±10）g，購自天津軍事科學(xué)院，合格證號0002257。動物于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，溫度23～25 ℃，濕度（50±5）%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實(shí)驗(yàn)遵循中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)定，符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤（2.5 mg/片，批號20100302）購自上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠；痹祺膠囊（國藥準(zhǔn)字Z10910026，批號311345，規(guī)格0.3 g/粒）購自天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司；牛Ⅱ型凍干膠原、不完全弗式佐劑，購自美國Chondrex公司；COMP ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋有限公司；qRT-RCR試劑和COMP、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

YLS-7B足趾容積測量儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；XSP-300型雙目顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；DG5032型酶聯(lián)免疫檢測儀（南京市華東電子團(tuán)體醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）；CFX96型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；恒溫離心機(jī)（江蘇省鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

牛Ⅱ型凍干膠原溶于乙酸，按1∶1與不完全弗式佐劑混勻制成乳劑。隨機(jī)選取10只SD大鼠作為對照組，其余大鼠尾根部sc 0.2 mL乳劑，第2周再次注射0.1 mL乳劑，對照組注射等體積生理鹽水。第3周將造模大鼠按足腫脹程度隨機(jī)分為模型組，痹祺膠囊中、高劑量（0.6、0.9 g/kg，相當(dāng)于臨床劑量的10、15倍）組，甲氨蝶呤（1.67 mg/kg，相當(dāng)于臨床劑量的10倍）組，每組10只。痹祺膠囊溶于生理鹽水分別配制成質(zhì)量濃度為0.06、0.09 g/mL的溶液，甲氨蝶呤溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為0.167 mg/mL的溶液。痹祺膠囊組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d；甲氨蝶呤組ig相應(yīng)藥物，1次/周，連續(xù)4周。用足趾容積測定儀測定大鼠后足體積，每2天1次，計算大鼠足腫脹率。

足腫脹率＝(隔日大鼠后足體積－第1天大鼠后足體積)/第1天大鼠后足體積

2.2 痹祺膠囊對RA大鼠血清COMP水平的影響

各組大鼠脫頸椎處死，腹主動脈取血后分離血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中COMP水平。

2.3 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜COMP蛋白表達(dá)的影響

取各組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)，按照SP試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書進(jìn)行切片顯色后，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察滑膜COMP陽性細(xì)胞并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性蛋白含量變化。

2.4 痹祺膠囊對RA大鼠軟骨中COMP mRNA表達(dá)的影響

取各組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)，按照Trizol試劑說明書提取大鼠軟骨總RNA，測定其質(zhì)量濃度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-RCR分析。引物序列：COMP上游引物為5’-GAGAACTTTGCCGTTGAA- GC-3’，下游引物為5’-GCTTCCTGTAGGTGGCAA- TC-3’；GAPDH上游引物為5’-CAGGGCTGCCTTC- TCTTGTG-3’，下游引物為5’-GATGGTGATGGGT- TTCCCGT-3’。qRT-RCR程序：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35次循環(huán)后延伸7 min。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 痹祺膠囊對RA大鼠一般情況的影響

模型組大鼠精神萎靡、毛色晦黯、體質(zhì)量增長遲緩、飲食減少、行動遲緩；各給藥組大鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量、毛色、飲食、行走步態(tài)均較模型組有所緩解。

3.2 痹祺膠囊對RA大鼠足腫脹率的影響

如圖1所示，造模2周內(nèi)，模型組大鼠足腫脹率升高，第15～23天給藥組大鼠足腫脹率降低，第24天給藥組較模型組大鼠足腫脹率降低。

3.3 痹祺膠囊對RA大鼠血清COMP水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中COMP水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中COMP水平顯著降低（＜0.001）。

圖1 痹祺膠囊對RA大鼠足腫脹率的影響()

表1 痹祺膠囊對RA大鼠血清COMP水平的影響()

與對照組比較：***＜0.001；與模型組比較：###＜0.001，下表同

***< 0.001control group;###< 0.001model group, same as blow table

3.4 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜COMP蛋白表達(dá)的影響

如圖2和表2所示，對照組滑膜未見COMP表達(dá)；與對照組比較，模型組滑膜可見大量陽性細(xì)胞，COMP蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組滑膜可見部分陽性細(xì)胞，COMP蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.001）。

圖2 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜中COMP蛋白表達(dá)的影響(×400)

表2 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜COMP蛋白表達(dá)的影響()

3.5 痹祺膠囊對RA大鼠軟骨中COMP mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠軟骨中COMP mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠軟骨中COMP mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.001）。

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：###P＜0.001

4 討論

RA是一種不可逆轉(zhuǎn)的自身免疫性疾病，其治療原則為抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制關(guān)節(jié)破壞。目前臨床上用于治療RA的藥物多為非甾體抗炎藥、皮質(zhì)類固醇、抗風(fēng)濕藥、生物制劑等，具有骨丟失、肝衰竭、呼吸衰竭等不良反應(yīng)[5-6]。甲氨蝶呤是RA治療的首選藥物，可選擇性作用于細(xì)胞S期，干擾細(xì)胞DNA的合成，抑制滑膜細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗炎作用，并可阻止滑膜侵襲軟骨及骨，延緩RA的病程進(jìn)展[7]。然而，長期服用甲氨蝶呤具有肝毒性、腫瘤抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)，可致胎兒畸形[8]。因此開發(fā)一種不良反應(yīng)小、便于長期服用的藥物對治療RA有重要意義。

痹祺膠囊是治療RA的常用中藥制劑，由三七、馬錢子、黨參、白術(shù)、丹參、川芎、甘草等藥物組成，全方具有散寒除濕、活血通絡(luò)的功效，經(jīng)多年臨床使用證實(shí)對RA有確切療效。痹祺膠囊對CIA大鼠后足腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和疼痛有明顯改善作用，可抑制CIA大鼠的原發(fā)性、繼發(fā)性損害，可通過下調(diào)白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表達(dá)，上調(diào)骨保護(hù)素表達(dá)，干預(yù)慢性滑膜炎癥、血管翳形成、軟骨及骨的破壞[9-12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，馬錢子可抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖，丹參可促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡并抑制其侵襲，從而抑制滑膜增生及血管翳的形成[13]。

COMP是RA診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。RA早期患者血清中COMP水平升高，滑膜COMP表達(dá)水平可用于觀察軟骨破壞及關(guān)節(jié)疾病預(yù)后[14]。Carlsen等[15]發(fā)現(xiàn)COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型依賴于由T細(xì)胞識別、呈遞分子的相容性復(fù)合體，而T細(xì)胞可促進(jìn)炎癥因子及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）產(chǎn)生，破壞軟骨代謝。本研究結(jié)果顯示，模型組血清中COMP水平、滑膜中COMP表達(dá)均顯著升高，提示CIA模型成功建立。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中COMP水平與疾病活動評分和軟骨破壞顯著相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠軟骨中COMP mRNA表達(dá)顯著升高，提示COMP可能通過誘導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生從而破壞軟骨；各劑量痹祺膠囊組血清中COMP水平、滑膜中COMP表達(dá)和軟骨中COMP mRNA水平均顯著降低，與甲氨蝶呤療效相當(dāng)。

綜上所述，痹祺膠囊可能通過下調(diào)血清中COMP水平、滑膜和軟骨中COMP表達(dá)，抑制炎性浸潤、滑膜增生和關(guān)節(jié)破壞，從而發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Sokka T, Kautiainen H, Toloza S,. QUEST-RA: Quantitative clinical assessment of patients with rheumatoid arthritis seen in standard rheumatology care in 15 countries [J]., 2007, 66(11): 1491-1496.

[2] Aletaha D, Neogi T, Silman A J,. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria: An American college of rheumatology/European league against rheumatism collaborative initiative [J]., 2010, 62(9): 2569-2581.

[3] McInnes I B, Schett G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis [J]., 2011, 365(23): 2205-2219.

[4] Andersson M L E, Svensson B, Petersson I F,. Early increase in serum-COMP is associated with joint damage progression over the first five years in patients with rheumatoid arthritis [J]., 2013, 14: 229.

[5] Baschant U, Lane N E, Tuckermann J. The multiple facets of glucocorticoid action in rheumatoid arthritis [J]., 2012, 8(11): 645-655.

[6] Albrecht K, Müller-Ladner U. Side effects and management of side effects of methotrexate in rheumatoid arthritis [J]., 2010, 28(5): 95-101.

[7] Brown P M, Pratt A G, Isaacs J D. Mechanism of action of methotrexate in rheumatoid arthritis, and the search for biomarkers [J]., 2016, 12(12): 731-742.

[8] Abbasi M, Mousavi M J, Jamalzehi S,. Strategies toward rheumatoid arthritis therapy; the old and the new [J]., 2019, 234(7): 10018-10031.

[9] 譚洪發(fā), 榮曉鳳, 徐艷明, 等. 痹祺膠囊對CIA大鼠OPG/RANKL表達(dá)的影響 [J]. 免疫學(xué)雜志, 2016, 32(10): 878-883.

[10] 邊新群, 劉維. 痹祺膠囊治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2006, 21(12): 773-774.

[11] 鄭雙融, 李寶麗. 痹祺膠囊對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜增殖及血清IL-18、TNF-α水平的影響 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2016, 31(8): 3330-3333.

[12] 夏璇, 王煥銳, 呂媛, 等. 痹祺膠囊治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床療效及影像學(xué)評價[J]. 中草藥, 2020, 51(13): 3518-3522.

[13] 方芳, 陳海波, 馬鳳森, 等. 馬錢子生物堿組分對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖作用的比較研究 [J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2013, 37(1): 1-4.

[14] Ahrman E, Lorenzo P, Holmgren K,. Novel cartilage oligomeric matrix protein (COMP) neoepitopes identified in synovial fluids from patients with joint diseases using affinity chromatography and mass spectrometry [J]., 2014, 289(30): 20908-20916.

[15] Carlsen S, Nandakumar K S, B?cklund J,. Cartilage oligomeric matrix protein induction of chronic arthritis in mice [J]., 2008, 58(7): 2000-2011.

[16] Algergawy S A, El-Sabour M A, Osman A S,. Early diagnostic and prognostic values of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and cartilage oligomeric matrix protein in rheumatoid arthritis [J]., 2013, 20(2): 11-20.

Study on mechanism of Biqi Capsule in treating collagen induced arthritis rats

ZHANG Dong-mei1, LI Bao-li2

1. Affiliated Hospital of Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300120, China 2. General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

To investigate the effect of Biqi Capsule (痹祺膠囊) on the expression of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in CIA rats.A total of 10 rats were randomly selected as control group, the other rats were used to establish CIA model, CIA rats were randomly divided into model group, low-, medium-dose Biqi Capsule (0.6, 0.9 g/kg) groups and methotrexate (1.67 mg/kg) group. After administration for 4 weeks, the changes of paw swelling in rat were observed; The level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were tested.Compared with control group, level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were significantly increased in model group (< 0.001); Compared with model group, level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were decreased in treatment groups (< 0.001).Biqi Capsule may prevent inflammatory infiltration, synoviocyte proliferation, cartilage destruction by inhibiting the expression of COMP, and then treat rheumatoid arthritis.

Biqi Capsule; rheumatoid arthritis; cartilage oligomeric matrix protein; collagen-induced arthritis; synovium

R285.5

A

0253 - 2670(2021)04 - 1059 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.019

2020-11-10

張冬梅，醫(yī)學(xué)碩士，從事風(fēng)濕免疫、內(nèi)分泌的臨床與藥理學(xué)研究。E-mail: 13516268238@163.com

李寶麗，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，從事風(fēng)濕免疫方向研究。E-mail: li3106@sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]