龐雯輝，趙希娟,2*，陳西，張耀海，王成秋，趙其陽，焦必寧*

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，西南大學(xué)柑桔研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶，400712)2(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)3(上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海，200335)

檸檬是柑橘生產(chǎn)上廣泛栽培的種類之一，除鮮食外，還可加工成檸檬汁、檸檬茶和檸檬果醬等[1]，深受人們青睞。檸檬中富含類黃酮、酚酸與類檸檬苦素等多種生物活性成分[2]，具有抗炎、抗氧化、抗癌及預(yù)防心血管疾病等生理功能[3-4]。因此，有必要對(duì)檸檬果實(shí)中主要生物活性成分進(jìn)行系統(tǒng)深入地研究，以指導(dǎo)消費(fèi)、醫(yī)藥和保健產(chǎn)品研發(fā)，為其資源化綜合利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

柑橘中生物活性成分通?；诟咝б合嗌V法、超高效液相色譜法(UPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法等手段分析，鄭潔等[5]利用UPLC建立了同時(shí)測(cè)定柑桔中主要酚酸和類黃酮組成及含量的方法。張阿敏等[6]利用高效液相色譜-質(zhì)譜法建立了測(cè)定贛南臍橙幼果中酚酸的檢測(cè)方法。DUGRAND等[7]建立了基于超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定柑橘中香豆素和呋喃香豆素的分析方法，并應(yīng)用于6種柑橘果皮中6種香豆素和21種呋喃香豆素的分離和定量。近年來，作為一種新型聯(lián)用技術(shù)，超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight high-resolution mass spectrometry, UPLC-Q-TOF-HRMS)具有快速、高效與高靈敏等特點(diǎn)[8-10]，可進(jìn)行靶向物和非靶向物的高分辨率篩選，目前廣泛應(yīng)用于果蔬中農(nóng)藥殘留篩查鑒定[11-12]、生物活性成分鑒定[3,13-14]以及果汁的真?zhèn)舞b別[15]。KE等[16]通過UPLC-QTOF-MS在7 min內(nèi)分離鑒定了7種柑橘果皮中的10種多甲氧基類黃酮(polymethoxylated flavonoids, PMFs)。XING等[14]利用UPLC-QTOF-MS在12 min內(nèi)分析和鑒定了14種寬皮柑橘和橙類果皮中的42種PMFs，其中8種PMFs在柑橘樣品為首次報(bào)道，但該研究?jī)H分析鑒定了PMFs。YANG等[17]建立了一種用于定性分析椪柑果皮中生物活性成分的UPLC-QTOF-MS方法，該方法在7 min內(nèi)初步鑒定了椪柑果皮中的24種類黃酮及8種其他化合物。ZHAO等[18]基于UPLC-QTOF-MS建立了一種分離莽山橘中生物活性成分的分析方法，其中已初步鑒定出81種化合物(主要為類黃酮和檸檬苦素)。LEDESMA-ESCOBAR等[19]基于液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)從檸檬提取物中初步鑒定出32種類黃酮、6種香豆素、5種酚酸、15種氨基酸和11種未分類化合物。以上研究大多集中于柑橘中的一類或兩類生物活性成分(主要是類黃酮)的初步篩查鑒定，而針對(duì)柑橘中多類型生物活性成分的快速篩查與準(zhǔn)確鑒定的方法研究較少。

目前基于UPLC-Q-TOF-HRMS技術(shù)對(duì)柑橘中生物活性成分的研究大多集中于寬皮柑橘和橙類，而對(duì)檸檬中生物活性成分的系統(tǒng)研究較少。以往的研究局限于柑橘中常見的類黃酮、酚酸等生物活性成分，尚缺乏多類型生物活性成分同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確篩查鑒定的方法研究。因此，本研究基于柑橘中常見的生物活性成分標(biāo)準(zhǔn)品建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(包括46種類黃酮、29種香豆素、10種酚酸、7種生物堿和3種類檸檬苦素)，同時(shí)利用UPLC-Q-TOF-HRMS技術(shù)，建立一種能夠快速分離與鑒定多類型生物活性成分的方法。并對(duì)6種檸檬不同部位的生物活性成分進(jìn)行篩查鑒定，為其功能食品的研究開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

6個(gè)檸檬品種(表1)于2019年11月采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家果樹種質(zhì)資源(重慶)柑橘圃，在三棵長(zhǎng)勢(shì)一致果樹上的不同果實(shí)著生方位(上、中、下、內(nèi)、外部)均勻地采摘20～30個(gè)處于成熟期的檸檬果實(shí)。

表1 試驗(yàn)材料具體信息Table 1 Specific information of the experimental materials

1.2 試劑

甲醇、乙腈均為色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；甲酸為色譜純，上海吉至生化科技有限公司；Milli-Q Advantage A10 超純水器，美國Millpore公司。本試驗(yàn)共有95種標(biāo)準(zhǔn)品，具體信息如下：甜菜堿、東莨菪內(nèi)酯、異補(bǔ)骨脂素、新北美圣草苷、5,7,3′,4′-四甲氧基黃酮、5-降甲基蜜桔黃素、甲基橙皮苷、地奧司明、香葉木素、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、梔子黃素B、蔓荊子黃素、檸檬苦素和諾米林的純度均為98.0%以上，成都克洛瑪生物科技有限公司；異茴芹內(nèi)酯、橙皮內(nèi)酯水合物、橙皮內(nèi)酯、水合氧化前胡素、氧化前胡素、異紫花前胡內(nèi)酯、花椒毒醇、白當(dāng)歸素、珊瑚菜素、蛇床子素、8-氧甲基異歐前胡內(nèi)酯、根皮苷、異槲皮苷、槲皮素、異橙黃酮、4′,5,7,8-四甲氧基黃酮、水仙苷、黃柏酮、沒食子酸、D-(-)-奎寧酸(純度均為98.0%以上)，4′,5,6,7-四甲氧基黃酮(純度95.0%)和3′,4,7,8-四甲氧基黃酮(純度95.0%)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；辛弗林(純度98.8%)、N-甲基酪胺(純度99.5%)、5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素(純度99.9%)、8-(牻)牛兒醇基補(bǔ)骨脂素(純度98.5%)、香檸檬亭(純度96.9%)，美國ChromaDex；苯腎上腺素(純度99.2%)、大麥芽堿(純度97.5%)、酪胺(純度98.5%)、橙皮油內(nèi)酯(純度98.5%)，美國Sigma-Aldrich；章魚胺(純度99.3%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH;其他標(biāo)準(zhǔn)品信息參照ZHAO等[20]。

將購買的標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇(上述購自上海源葉生物技術(shù)有限公司的標(biāo)準(zhǔn)品除黃柏酮外，其他均加入極少量的DMSO使其溶解)配制成2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，放置于低溫下(-50 ℃)保存。使用甲醇將上述標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液備用。

1.3 儀器與設(shè)備

KQ5200DE超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q AdvantageA10超純水系統(tǒng)，美國Millipore；3K15高速冷凍離心機(jī)，美國Sigma-Aldrich；PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g)，瑞士梅特勒-托利多公司；Acquity UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，美國Waters；Nexera X2 UPLC，日本島津公司；SCIEX X500R QTOF，美國AB SCIEX公司。

1.4 樣品準(zhǔn)備

樣品取樣參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8210—2011，參照朱麗莎等[21]方法進(jìn)行樣品果皮、果肉與果汁的制備。

果皮、果肉與果汁前處理：取樣品5 g置于離心管中，加入10 mL(果肉5 mL)甲醇，在室溫條件下200 W超聲30 min，10 000 r/min下離心5 min，上清液置于50 mL(果肉25 mL)容量瓶中，重復(fù)提取4次，最后用甲醇定容至50 mL(果肉25 mL)。提取液用0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 液相條件

色譜柱為Acquity UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液(A)與乙腈(B)，進(jìn)樣量為1.0 μL，流速為0.3 mL/min。采用梯度洗脫程序，正離子模式：0～0.2 min，10%～25%B；0.2%～4.5 min，25%～45%B；4.5～4.6 min，45%～65%B；4.6～8 min，65%～75%B；8～8.5 min，75%～95%B；8.5～10.4 min，95%B；10.4～10.5 min，95～10%B；10.5～13 min，10%B，負(fù)離子模式：0～0.2 min，10%～25%B；0.2～4 min，25%～40%B；4～4.1 min，40%～70%B；4.1～6 min，70%～77%B；6～6.1 min，77%～10%B；6.1～8 min，10%B。

1.6 質(zhì)譜條件

AB SCIEX X500R QTOF高分辨四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的質(zhì)譜數(shù)據(jù)是采用信息依賴掃描(information-dependent acquisition，IDA)模式在正、負(fù)2種離子模式下獲得的。在正離子模式下，渦輪噴霧離子源參數(shù)：霧化氣50.0 psi；燥氣50.0 psi；氣簾氣35.0；離子源溫度550.0 ℃。TOF-MS參數(shù)：掃描范圍100～800 Da；離子源電壓5 500.0 V；去簇電壓(80±40)V；累積時(shí)間0.1 s。IDA參數(shù)：最大候選離子數(shù)10；觸發(fā)二級(jí)碎裂掃描的離子強(qiáng)度閾值10 cps；動(dòng)態(tài)背景扣除；質(zhì)荷比誤差范圍50 mDa。TOF-MS-MS參數(shù)：掃描范圍 50～800 Da；碰撞電壓(40±20) V；累積時(shí)間0.05 s。在負(fù)離子模式下，離子源電壓4 500.0 V;離子源溫度450.0 ℃，其他參數(shù)與正離子模式相同。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)AB SCIEX OS與AB LibraryView 1.3.1軟件結(jié)合進(jìn)行生物活性成分篩查鑒定：首先基于每種生物活性成分的前體離子質(zhì)量對(duì)檸檬提取物進(jìn)行靶向篩查，對(duì)于符合的物質(zhì)(前體離子質(zhì)量偏差在±5 mg/L),再比較檸檬提取物與標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的提取離子流圖中對(duì)應(yīng)參照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是否一致，若一致，最后再將其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息與本文構(gòu)建的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，匹配成功即可確定檸檬提取樣品中含有該種化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物活性成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

本試驗(yàn)對(duì)每一種生物活性成分的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行IDA模式掃描，并利用LibraryView 1.3.1軟件構(gòu)建了含有46種類黃酮、29種香豆素、10種酚酸、7種生物堿和3種類檸檬苦素在內(nèi)的95種生物活性成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，其包含了每種生物活性成分的分子式、結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)、離子模式、碰撞能量、精確質(zhì)量與二級(jí)質(zhì)譜碎片離子譜圖等信息(附表1，https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20201113001)。此數(shù)據(jù)庫可根據(jù)靶向篩查目標(biāo)物的變化來進(jìn)行擴(kuò)展應(yīng)用，同時(shí)為非靶向生物活性成分的篩查技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

2.2 儀器參數(shù)與條件優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本試驗(yàn)在正、負(fù)離子模式下分別對(duì)95種生物活性成分進(jìn)行前體離子掃描，確定其最佳的離子模式。結(jié)果顯示，負(fù)離子模式適用于酚酸、個(gè)別香豆素以及部分類黃酮，正離子模式適用于其他物質(zhì)。

2.2.2 液相條件優(yōu)化

多類型生物活性成分同時(shí)分析的關(guān)鍵點(diǎn)主要在于異構(gòu)體的分離和色譜洗脫時(shí)間的縮短。本實(shí)驗(yàn)考察了0.01%甲酸水-甲醇、0.01%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈4種流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)物的分離和離子化效率的影響。結(jié)果表明，在0.1%甲酸水-乙腈體系下，離子化和異構(gòu)體的分離效果更好。

本試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)化合物中包含22對(duì)同分異構(gòu)體，它們具有相似的分子結(jié)構(gòu)，甚至部分二級(jí)質(zhì)譜的特征離子碎片也基本相同，如香蜂草苷和枸橘苷，分子式均為C18H34O14，前體離子質(zhì)量為595.20 Da，且二級(jí)特征離子碎片也均為287.09、153.02、195.03、161.06，等度洗脫下兩者很難完全分離，故需要采用色譜梯度洗脫并進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果見1.5，正離子模式下共有78種物質(zhì)(包括19對(duì)同分異構(gòu)體)在11 min內(nèi)有效分離(圖1-A)，負(fù)離子模式下共有39種物質(zhì)(包括6對(duì)同分異構(gòu)體)在6 min內(nèi)有效分離(圖1-E)。其中5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃酮與5-羥基-7,8,4′-三甲氧基黃酮、牡荊素與異牡荊素這兩對(duì)同分異構(gòu)體未能有效分離開，第一對(duì)同分異構(gòu)體的二級(jí)碎片離子相差較大，因此可根據(jù)其二級(jí)碎片離子的差異性來進(jìn)行區(qū)分。但第二對(duì)同分異構(gòu)體的二級(jí)碎片離子相差不大，故無法準(zhǔn)確將其區(qū)分，因此將此對(duì)異構(gòu)體視為具有C21H20O10結(jié)構(gòu)的化合物，命名為牡荊素與異牡荊素及其異構(gòu)體。

2.3 檸檬樣品中生物活性成分的篩查鑒定

6種檸檬樣品的果皮、果肉與果汁提取物中生物活性成分的鑒定結(jié)果如附表1所示。從圖1可以看出，扁紅檸檬果皮、果肉與果汁提取物的提取基峰離子流圖的不同峰位置的響應(yīng)值相差較大，這說明在扁紅檸檬不同部位中含量高的生物活性成分不盡相同。

A～D：正離子模式；E～H：負(fù)離子模式圖1 標(biāo)準(zhǔn)品混合液和扁紅檸檬在正、負(fù)離子模式下的提取基峰離子流圖Fig.1 Base peak chromatograms (BPC) of the mixed standards and Bianhongningmeng in positive and negative ion mode

2.3.1 類黃酮的篩查鑒定

類黃酮是柑橘類水果中最常見的一類生物活性成分[22]?，F(xiàn)以化合物41為例來闡述類黃酮的鑒定過程?；衔?1在6.27 min存在m/z403.138 7[M+H]+的前體離子，其特征離子碎片如圖2-A所示，分別有m/z373.090 6[M+H-CH3]+與m/z388.115 9[M+H-2CH3]+等碎片離子，基于與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中參照標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間以及碎片離子的比對(duì)，化合物48被鑒定為川陳皮素。

A-化合物41；B-化合物58；C-化合物3；D-化合物76；E-化合物88圖2 五個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖和碎片離子信息Fig.2 Mass/mass spectrum and fragmentation ion information of 5 compounds

對(duì)于有相同m/z373.128 2[M+H]+前體離子的異構(gòu)體化合物33、36和43來講，可根據(jù)其出峰先后順序(圖3)，即保留時(shí)間的差異來區(qū)分，并與參照標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)來確定化合物33、36和43分別為異甜橙黃酮、甜橙黃酮和桔皮素。

圖3 扁紅檸檬果皮樣品中提取的m/z 373.128 2[M+H]+的 XIC 離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of XIC traces of m/z 373.128 2[M+H]+ in the peel extract of Bianhongningmeng注：化合物33異甜橙黃酮在5.67 min出峰；化合物36甜橙黃酮在5.98 min出峰；化合物43桔皮素在6.63 min出峰

6種檸檬中篩查鑒定到的類黃酮數(shù)量排序如下：扁紅檸檬(35種)>北京檸檬(33種)>美國粗檸檬(32種)>柯爾提粗檸檬(31種)>里斯本=尤力克(29種)，對(duì)于不同部位篩查鑒定到的類黃酮數(shù)量呈以下規(guī)律：果皮≥果肉≥果汁。如附表1所示，橙皮苷、蘆丁、川陳皮素、新西蘭牡荊苷與牡荊素-2-O-鼠李糖苷等24種類黃酮在6種檸檬中均可檢出，而香蒲新苷、新北美圣草苷、枸橘苷、金合歡素與新橙皮苷僅在扁紅檸檬中檢出，櫟精-3,7,3′,4′-四甲醚和異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷分別僅在北京檸檬果皮與尤力克檸檬果皮中檢出，5-羥基-7,8,4′-三甲氧基黃酮僅在柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬和北京檸檬3種中檢出，5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黃酮僅在扁紅檸檬、尤力克和北京檸檬3種中檢出。半齒澤蘭素-5-甲基醚和5,7,3′,4′-四甲氧基黃酮在扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬和北京檸檬4種中檢出，香蜂草苷僅在里斯本、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬和北京檸檬4種中檢出。柚皮苷在扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬、里斯本與北京檸檬5種中檢出，新地奧司明在扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬、里斯本與尤力克檸檬5種中檢出，甲基橙皮苷在柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬、里斯本、尤力克和北京檸檬5種中檢出，而柚皮苷在尤力克檸檬、新地奧司明在北京檸檬和甲基橙皮苷在扁紅檸檬中均未檢出。檸檬果實(shí)中的類黃酮主要以黃烷酮為主[23]，柚皮素、橙皮苷及圣草次苷等黃烷酮在6種檸檬中均能檢出，而有關(guān)檸檬中PMFs的研究較少，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道[5, 24]在檸檬中鑒定出川陳皮素、桔皮素及甜橙黃酮等PMFs，其中川陳皮素、桔皮素、甜橙黃酮和4′,5,7,8-四甲氧基黃酮等PMFs在本試驗(yàn)檸檬樣品中均能檢出。

2.3.2 香豆素的篩查鑒定

香豆素是一種具有氧雜環(huán)基本結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，試驗(yàn)表明，大多數(shù)香豆素的加合離子為[M+H]+，其主要通過丟失CH3(15 Da)、CO(28 Da)、2CO(56 Da)等基團(tuán)來產(chǎn)生碎片離子[25]。如化合物58在 5.89 min時(shí)產(chǎn)生m/z217.049 5[M+H]+的前體離子，其二級(jí)特征離子碎片分別為m/z202.025 9[M+H-CH3]+、m/z174.031 6[M+H-CH3-CO]+與m/z146.036 8[M+H-CH3-2CO]+(圖2-B)。化合物58與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子基本一致，即可確認(rèn)其為佛手柑內(nèi)酯。

從6種檸檬中篩查鑒定到的香豆素?cái)?shù)量排序如下：尤力克(25種)>柯爾提粗檸檬=北京檸檬(23種)>里斯本(22種)>扁紅檸檬(20種)>美國粗檸檬(15種)，檸檬果皮、果肉與果汁中篩查到的香豆素?cái)?shù)量呈依次遞減趨勢(shì)。附表1所示，橙皮內(nèi)酯水合物、濱蒿內(nèi)酯與佛手柑內(nèi)酯等11種香豆素在6種檸檬中均檢出，除異補(bǔ)骨脂素和花椒毒素外，其他27種香豆素在6種檸檬中均有檢出。補(bǔ)骨脂素和6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭僅在扁紅檸檬果皮中檢出，花椒毒醇僅在尤力克檸檬果皮中檢出，歐前胡素僅在里斯本和尤力克檸檬兩種中檢出，8-氧甲基異歐前胡內(nèi)酯僅在柯爾提粗檸檬、尤力克和北京檸檬3種中檢出，異歐前胡素僅在柯爾提粗檸檬、里斯本、尤力克和北京檸檬4種中檢出。異紫花前胡內(nèi)酯在扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬、尤力克和北京檸檬5種中檢出，橙皮內(nèi)酯、8-(牻)牛兒醇基補(bǔ)骨脂素、香檸檬亭、5-香葉氧基-7-甲氧基香豆素、東莨菪內(nèi)酯與香柑醇在扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬、里斯本、尤力克和北京檸檬5種中均可檢出，白當(dāng)歸素、氧化前胡素與珊瑚菜素在美國粗檸檬、柯爾提粗檸檬、里斯本、尤力克和北京檸檬5種中檢出。

2.3.3 生物堿的篩查鑒定

生物堿是一類存在于蕓香科柑橘屬植物中的含氮化合物[26]。在本實(shí)驗(yàn)條件下，化合物3在0.87 min時(shí)被快速洗脫，存在m/z168.101 9[M+H]+的前體離子，其特征碎片離子m/z150.091 3[M+H-18]+由前體離子丟失H2O(18 Da)得到，在其基礎(chǔ)上丟失—CH3(15 Da)得到碎片離子m/z135.067 5[M+H-18-15]+，m/z107.049 0[M+H-18-15-28]+與m/z77.038 5[M+H-18-15-28-30]+均為其碎片離子(圖2-C)。基于保留時(shí)間和碎片離子與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中參照標(biāo)準(zhǔn)品的相似性，化合物3被確認(rèn)為辛弗林。

從附表1可以看出，北京檸檬果皮中篩查鑒定到的生物堿最多，為辛弗林、苯腎上腺素、甜菜堿、章魚胺、酪胺和N-甲基酪胺6種生物堿，但果肉與果汁中僅篩查到甜菜堿、章魚胺、酪胺和N-甲基酪胺4種生物堿。扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬和美國粗檸檬的果皮、果肉與果汁中均可篩查鑒定甜菜堿、辛弗林、苯腎上腺素、N-甲基酪胺及大麥芽堿5種生物堿。里斯本與尤力克檸檬中篩查鑒定到的生物堿最少，果皮中為甜菜堿與N-甲基酪胺，果肉與果汁中僅鑒定到甜菜堿。

2.3.4 類檸檬苦素的篩查鑒定

類檸檬苦素主要以糖甙和甙元2種形態(tài)存在[27-28]，是一類高度氧化的四環(huán)三萜類植物次生代謝物質(zhì)[29]，檸檬苦素、諾米林和黃柏酮是存在于檸檬中最主要的3種。現(xiàn)以化合物76為例，其在6.00 min時(shí)產(chǎn)生m/z471.201 3[M+H]+前體離子，如圖2-D所示，在m/z161.059 5[M+H-310]+和m/z425.194 6[M+H-46]+產(chǎn)生較強(qiáng)的二級(jí)特征碎片離子，其中m/z425.194 6[M+H-46]+是由前體離子丟失CO(28 Da)和H2O(18 Da)得到。通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中參照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和碎片離子的比對(duì)，確認(rèn)化合物76為檸檬苦素。結(jié)果表明，3種類檸檬苦素的碎片離子信息均與先前文獻(xiàn)報(bào)道相符[30-31]。

6種檸檬的果皮、果肉與果汁中均可篩查鑒定到檸檬苦素和諾米林，黃柏酮僅在柯爾提粗檸檬的果皮以及扁紅檸檬、柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬、里斯本和尤力克檸檬的果肉中檢出(附表1)。

2.3.5 酚酸的篩查鑒定

酚酸類化合物系指同一個(gè)苯環(huán)上有若干個(gè)羥基的芳香羧酸類化合物[32]?；衔?8在2.77 min時(shí)產(chǎn)生m/z193.050 6[M-H]-前體離子，如圖2-E所示，其特征碎片離子分別為m/z178.027 0[M-H-CH3]-、m/z149.060 9[M-H-COOH]-與m/z134.037 5[M-H-CH3-COOH]-，基于與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中參照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和碎片離子的比對(duì)，確認(rèn)化合物88為阿魏酸。

從附表1可看出，D-(-)-奎寧酸、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、對(duì)香豆酸與阿魏酸在6種檸檬中均可檢出。綠原酸僅在扁紅檸檬果皮中檢出，原兒茶酸僅在柯爾提粗檸檬、美國粗檸檬、里斯本和北京檸檬4種中檢出，芥子酸在扁紅檸檬、美國粗檸檬、柯爾提粗檸檬、里斯本與尤力克檸檬5種中均可檢出。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在6種檸檬中共檢出40種類黃酮，27種香豆素，9種酚酸、7種生物堿和3種類檸檬苦素，而有5種類黃酮(7,8,3′,4′-四甲氧基黃酮、5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃酮、斯皮諾素、根皮苷與根皮素)、2種香豆素(異補(bǔ)骨脂素與花椒毒素)與1種酚酸(沒食子酸)在6種檸檬中均未檢出。從6種檸檬樣品的篩查結(jié)果(附表1)可以看出，其品種差異和組織差異明顯。香蒲新苷、新北美圣草苷、枸橘苷、金合歡素(果皮與果肉)、新橙皮苷、補(bǔ)骨脂素(果皮)、6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭(果皮)與綠原酸(果皮)僅在扁紅檸檬中檢出；異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷與花椒毒醇僅在尤力克檸檬果皮中檢出；章魚胺、酪胺、櫟精-3,7,3′,4′-四甲醚(果皮)僅在北京檸檬中檢出。以上這些僅能在單個(gè)品種檢測(cè)到的目標(biāo)物，可視為區(qū)分其他5種檸檬的特征成分，為篩查不同品種檸檬差異代謝物、品種選育和功能食品開發(fā)提供參考。

基于本研究構(gòu)建的柑橘生物活性成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，利用UPLC-QTOF-HRMS技術(shù)，建立了同時(shí)快速準(zhǔn)確篩查鑒定93種多類型生物活性成分的新方法，并應(yīng)用于實(shí)際檸檬樣品檢測(cè)分析。該方法具有良好的選擇性，可準(zhǔn)確鑒定21對(duì)同分異構(gòu)體。質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的生物活性成分有86種均能在6種檸檬樣品中檢出，且不同品種、不同部位的生物活性成分差異明顯。該方法具有通用性，適用于柑橘類水果中生物活性成分的快速篩查鑒定。