姜露，葉麟，侯曉艷，申光輝，黎杉珊，張志清*

1(濮陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河南 濮陽，457000)2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)3(四川國檢檢測有限責(zé)任公司，四川 瀘州，646000)

農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題一直倍受政府和公眾的關(guān)注，雖然我國對食品安全問題(包括蔬菜中農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn))高度重視，但是由于我國蔬菜種植戶分散，管理困難，所以仍存在農(nóng)藥使用超范圍、非法添加隱性成分、超量使用等問題導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)[1]。農(nóng)藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象非常嚴(yán)重，在國內(nèi)外普遍存在[2-4]。大量數(shù)據(jù)表明，蔬菜和水果中殘留的農(nóng)藥種類主要是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類，其中有機(jī)磷農(nóng)藥在當(dāng)前殺蟲劑市場份額中占70%[5]。因此開發(fā)快速檢測農(nóng)產(chǎn)品特別是蔬菜和水果中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法具有非常重要的意義。

目前，我國應(yīng)用比較廣泛的快速檢測方法是酶抑制法，該法所測樣品的前處理要求簡單、成本低、檢測時(shí)間短，非常適合我國小規(guī)模分散的銷售體系中經(jīng)常性的現(xiàn)場快速檢測，我國也已將該方法列入國家標(biāo)準(zhǔn)。但是經(jīng)過長期的檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有些辛辣類的蔬菜，如蔥、大蒜、韭菜等無論是用氣相色譜法還是酶抑制法均會(huì)對檢測結(jié)果造成假陽性現(xiàn)象[6-7]。尤其是酶抑制法，國標(biāo)中明確表明蔥、蒜、蘿卜、韭菜等辛辣蔬菜中含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性[8]。因?yàn)檫@類蔬菜中富含蒜氨酸類物質(zhì)及其活性酶[9]。當(dāng)細(xì)胞破損后，酶會(huì)作用底物產(chǎn)生具有辛辣味的含硫化合物。該硫化物的結(jié)構(gòu)與有機(jī)磷、有機(jī)氯等農(nóng)藥相似[10]，因此對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。對于這類蔬菜一方面多采用磷酸處理[11]，但這種方法污染環(huán)境、造成試劑的浪費(fèi)，且殘留的磷酸會(huì)對儀器及結(jié)果重復(fù)性產(chǎn)生較大影響；另一方面采用整株(體)蔬菜浸提或表面測定法[12]，也只能減少而不是消除假陽性干擾。

為了更好地解決辛辣類蔬菜對快速檢測中的酶抑制法產(chǎn)生假陽性的問題，并為麥麩酯酶作為植物酶源，在檢測使用中提供真實(shí)可靠的依據(jù)。課題組前期已從麥麩中提取到具有較高活性的麥麩酯酶并對其動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了研究[13-14]，本文在其研究的基礎(chǔ)上對市面上常見的4種辛辣蔬菜進(jìn)行不同的加熱處理，以期能減少或盡可能消除假陽性對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩酯酶，實(shí)驗(yàn)室自制；洋蔥、香蔥、大蒜、青椒，雅安市市售。

有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：敵敵畏(液體1.00 mg/mL)、甲基對硫磷(液體1.00 mg/mL)、樂果(液體1.00 mg/mL)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：丁硫克百威(液體1.00 mg/mL)、西維因(固體純度≥99.8%)、葉蟬散(固體純度≥99.8%), 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；α-乙酸萘酯,上海源葉生物科技有限公司；固蘭B鹽,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；其他常用試劑均為分析純。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液：6種農(nóng)藥全部配制成10 mg/L的儲(chǔ)備液(丙酮)，將敵敵畏、葉蟬散、西維因用0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)稀釋成0.10、0.25、0.50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；樂果、甲基對硫磷、丁硫克百威用0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)稀釋成1.00、1.50、2.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

CP225D電子天平，德國Sartorius股份公司；HS6150D超聲波清洗儀，恒奧科技有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-3100紫外可見分光光度儀計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)，美國密理博公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麥麩酯酶的制備及蔬菜樣品的預(yù)處理

1.3.1.1 麥麩酯酶的制備

從麥麩中提取麥麩酯酶參考葉麟等[15]的方法。

1.3.1.2 蔬菜的預(yù)處理

取香蔥、青椒、洋蔥和大蒜4種辛辣蔬菜用自來水、蒸餾水分別洗滌3次，放在干燥處并用濾紙片擦干備用。

1.3.2 蔬菜樣品提取液的制備

將4種蔬菜樣品剪成1 cm2的碎片[16]，香蔥、大蒜各2 g，青椒、洋蔥各4 g放入提取瓶中，加入10 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))磷酸鹽緩沖液，使所有的樣品都浸在溶液中，超聲提取5 min，將上清液用濾紙過濾(青椒需要用0.45 μm濾膜過濾)，濾液備用。

1.3.3 樣品提取液對酶活性抑制率的測定

麥麩酯酶酶活抑制率的測定參考侯曉艷等[13]的方法，并稍作修改。于試管中加入4.25 mL的樣品提取液，再加入0.25 mL麥麩酯酶，混勻后在35 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min。取出試管加入0.25 mL α-乙酸萘酯溶液，40 ℃恒溫水浴5 min后加入0.25 mL固蘭B鹽，再加入0.25 mL表面活性劑搖勻，最后加入20%(體積分?jǐn)?shù))0.25 mL鹽酸溶液搖勻后讀取吸光度值A(chǔ)1，作為實(shí)驗(yàn)組。用提取液替代樣品提取液做為空白對照組A0，其他操作與樣品提取液測定方法相同，通過測得的吸光度值計(jì)算酶活性抑制率，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 微波加熱處理后樣品提取液對酶活性抑制率的影響

準(zhǔn)確稱取20 g樣品(大蒜整個(gè)、香蔥和青椒整株、洋蔥整片)放入100 mL的燒杯中，立即放入微波540 W加熱，改變微波時(shí)間0、20、40、60、80、100 s，冷卻后取出。按照方法1.3.2制備樣品提取液，然后按照方法1.3.3測定酶活性抑制率，考察不同微波時(shí)間下蔬菜樣品提取液對麥麩酯酶抑制率的影響。

1.3.5 水浴加熱處理樣品提取液對酶活性抑制率的影響

將4種蔬菜樣品提取液置于恒溫水浴鍋中加熱1 min，加熱溫度設(shè)置為25、70、80、90、100 ℃，加熱后樣品提取液冷卻到室溫，然后按照方法1.3.3測定酶活性抑制率，考察不同加熱溫度下蔬菜樣品提取液對麥麩酯酶抑制率的影響。

1.3.6 樣品提取液水浴加熱不同時(shí)間下對酶活性抑制率的影響

將4種蔬菜樣品提取液置于最適溫度下的恒溫水浴鍋中分別加熱1、2、3 min后取出冷卻，然后按照方法1.3.3測定酶活性抑制率，考察不同加熱時(shí)間下蔬菜樣品提取液對麥麩酯酶抑制率的影響。

1.3.7 不同處理?xiàng)l件下農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液對酶活性抑制率的影響

用提取液分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的農(nóng)藥標(biāo)樣(敵敵畏、葉蟬散、西維因)和1.0 mg/L的農(nóng)藥標(biāo)樣(樂果、甲基對硫磷、丁硫克百威)。通過上述實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)的蔬菜處理方法，然后將含有農(nóng)藥的提取液在最優(yōu)條件下處理，按照1.3.3方法測定麥麩酯酶酶活性抑制率，考察農(nóng)藥在此條件下的穩(wěn)定性。

1.3.8 辛辣蔬菜樣品提取液中農(nóng)藥殘留檢測

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最優(yōu)的辛辣蔬菜處理方法。為了保證驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，不采用噴灑的方法，而是直接將農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品添加到蔬菜樣品提取液中。使經(jīng)過處理的樣品提取液中敵敵畏、葉蟬散、西維因農(nóng)藥質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、0.50 mg/L，樂果、甲基對硫磷、丁硫克百威質(zhì)量濃度分別為1.00、1.50、2.00 mg/L作為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)在未經(jīng)處理的樣品提取液和磷酸鹽緩沖液中添加相應(yīng)的農(nóng)藥作為對照組，按照1.3.3方法進(jìn)行檢測，并計(jì)算酶活性抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除特殊標(biāo)注外均采用3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件，并采用Origin 9.1進(jìn)行作圖，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。并采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)顯著性分析，0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 微波加熱處理后樣品提取液對酶活性抑制率的影響

將4種蔬菜樣品提取液在540 W下微波處理不同的時(shí)間后測定酶活性抑制率，結(jié)果如圖1所示。微波的作用是使含硫蔬菜中活性酶失活，這樣在切碎時(shí)就不會(huì)產(chǎn)生含硫化合物，大大減少測定干擾。由于香蔥的含水量比較少，所以當(dāng)超過50 s后就會(huì)完全失水呈烘干狀態(tài)，所以只考慮其在0～50 s內(nèi)對酶活性抑制率的影響。0～20 s時(shí)4種辛辣蔬菜對麥麩酯酶的酶活性抑制率均顯著下降(P<0.05)，其中除大蒜外，其他3種蔬菜在20 s時(shí)酶活性抑制率均達(dá)到最低，分別為香蔥12.97%、青椒33.80%、洋蔥16.77%。而大蒜在40～60 s時(shí)酶活性抑制率達(dá)到最低為6.49%，且40 s和60 s差異不顯著(P>0.05)。可能是因?yàn)榇笏庹甑倪M(jìn)行微波處理，比較厚，所以處理時(shí)間稍微久一點(diǎn)。當(dāng)各蔬菜樣品提取液對酶活性抑制率達(dá)到最低后隨著微波加熱時(shí)間的延長又呈現(xiàn)上升的趨勢，可能是因?yàn)殡S著微波處理時(shí)間繼續(xù)延長，蔬菜呈疲軟狀，細(xì)胞破碎，汁液流失，加速含硫化合物的生成，最終導(dǎo)致酶活性抑制率升高。除香蔥外其余3種蔬菜在80～100 s時(shí)又呈下降的趨勢，可能是因?yàn)槲⒉〞r(shí)間過長，蔬菜嚴(yán)重缺水呈烘干狀態(tài)，已完全不能食用，促使含硫化合物的酶失活。因此除大蒜微波加熱需要40 s外，其他3種蔬菜微波加熱20 s，但是該方法對青椒不適用，其最低抑制率仍能達(dá)到33%左右。

圖1 不同微波處理時(shí)間對酶活性抑制率的影響Fig.1 The effect of different microwave processing time on the activity inhibition rate

2.2 水浴加熱處理后樣品提取液對酶活性抑制率的影響

水浴加熱的作用和微波是一樣的，均是使辛辣蔬菜中可促使含硫化合物生成的活性酶失活，這樣在切碎時(shí)就不會(huì)產(chǎn)生含硫化合物，大大減少測定干擾。

由圖2可知，4種蔬菜樣品提取液在25～80 ℃時(shí)都會(huì)使酶活性抑制率顯著降低(P<0.05)，在80～90 ℃時(shí)除洋蔥外，其余3種蔬菜對酶活性抑制率差異不顯著(P>0.05)；在90～100 ℃時(shí)，4種蔬菜對酶活性抑制率差異均不顯著(P>0.05)。因此，洋蔥樣品提取液在90 ℃時(shí)可達(dá)到消除假陽性效果，其對酶活性抑制率由原來的20.50%降低到2.95%，差異極顯著(P<0.01)，香蔥、青椒、大蒜均在80 ℃時(shí)對酶活性抑制率分別由原來的37.06%、50.34%、17.02%降低到12.69%、33.61%、5.79%，差異極顯著(P<0.01)。雖然青椒提取液經(jīng)過加熱處理前后對酶活抑制率差異極顯著，但是仍比較接近陽性判定值[16]，假陽性消除效果不理想，所以除青椒外，使用該方法進(jìn)行處理對其他3種蔬菜均可達(dá)到消除假陽性效果。由圖1和圖2 可知，這2種方法均可以降低辛辣蔬菜樣品提取液對酶活性的抑制作用，而且效果除洋蔥外差異不是很大。但是微波加熱由于處理時(shí)間、蔬菜的不同差異比較大，不容易掌控，而水浴加熱是對樣品提取液進(jìn)行處理，所以更容易控制。由于青椒經(jīng)過微波和水浴處理后，其對酶活性抑制率仍然高達(dá)33%左右，說明該方法不能有效消除檢測青椒時(shí)產(chǎn)生的假陽性。是由于樣品本身含有農(nóng)藥殘留所造成的假陽性無法消除，還是該方法不適用于青椒還有待進(jìn)一步研究，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不再將青椒作為分析樣品。

圖2 不同水浴溫度對酶活性抑制率的影響Fig.2 The effect of different water bath calefaction temperature on the activity inhibition rate

2.3 水浴加熱不同時(shí)間后樣品提取液對酶活性抑制率的影響

從表1可以得出，當(dāng)加熱溫度達(dá)到一定值時(shí)，加熱時(shí)間對酶活性抑制率的影響差異不顯著(P>0.05)。因此，為了操作簡便省時(shí)，避免殘留農(nóng)藥的損失，選擇最短加熱時(shí)間1 min。青椒樣品提取液對酶活性抑制率也沒有隨加熱時(shí)間的增加而降低，進(jìn)一步說明該方法不能有效去除青椒對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的假陽性影響。

表1 不同處理時(shí)間下樣品提取液對酶活性抑制率的影響 單位：Table 1 The effect of different processing time on activity inhibition rate

2.4 不同溫度下加熱農(nóng)藥對酶活性抑制率的影響

由表2可知，6種不同濃度的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥分別在水浴溫度為80、90 ℃與25 ℃室溫條件下測定的酶活性抑制率差異不顯著(P>0.05)，說明這6種農(nóng)藥在80～90 ℃加熱1 min可以保持良好的穩(wěn)定性。因此，實(shí)驗(yàn)前對辛辣蔬菜處理的優(yōu)化方法不會(huì)對殘留農(nóng)藥造成損失，可以在實(shí)際檢測中應(yīng)用。

表2 不同溫度下農(nóng)藥對麥麩酯酶酶活抑制率的影響 單位：%Table 2 Pesticides at different temperatures on the influence of activity inhibition rate

2.5 辛辣蔬菜樣品提取液中農(nóng)藥檢測

2.5.1 三種蔬菜中添加敵敵畏農(nóng)藥的檢測

選定最優(yōu)的水浴溫度作為實(shí)驗(yàn)條件，對3種蔬菜添加不同質(zhì)量濃度的敵敵畏分別進(jìn)行檢測，并以室溫條件下的提取液和蔬菜樣品提取液中添加相應(yīng)濃度農(nóng)藥作為參比。由圖3可知，含有不同濃度敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)液的3種蔬菜樣品提取液經(jīng)過加熱處理后對麥麩酯酶抑制率均比未經(jīng)過加熱處理的抑制率低，且與添加不同濃度的提取液對麥麩酯酶的抑制作用沒有顯著差異。未經(jīng)過加熱處理的樣品提取液對麥麩酯酶的抑制率隨著農(nóng)藥添加量的增大而增大。在敵敵畏添加濃度較低時(shí)，同種蔬菜經(jīng)過加熱處理的抑制率和未經(jīng)加熱處理的抑制率數(shù)值差異較大，當(dāng)農(nóng)藥添加質(zhì)量濃度達(dá)到最大值時(shí)(0.5 mg/L)，同種蔬菜經(jīng)過加熱和未加熱處理的抑制率差異明顯減少。可能是因?yàn)樵谵r(nóng)藥添加量少的情況下，抑制率主要受到蔬菜中含硫化合物的影響，而加熱可以在一定程度上消除這種影響；而在農(nóng)藥添加量多的情況下，抑制率的升高主要是由農(nóng)藥引起的，并非蔬菜里的干擾物質(zhì)，此時(shí)抑制率的升高就不僅僅是假陽性現(xiàn)象。

a-香蔥；b-洋蔥；c-大蒜圖3 蔬菜中添加敵敵畏濃度與抑制率關(guān)系Fig.3 The relationship between dichlorvos concentration and inhibition rate in the vegetables

2.5.2 三種蔬菜中添加其他多種農(nóng)藥的檢測

與上文相似，分別將樂果、甲基對硫磷、葉蟬散、西維因和丁硫克百威5種農(nóng)藥添加到3種蔬菜樣品提取液及提取液中配制成不同濃度在25 ℃室溫和最佳溫度下水浴加熱進(jìn)行檢測，以不加熱的樣品提取液作為參比，結(jié)果如表3所示。香蔥樣品提取液中分別添加5種農(nóng)藥配制成低濃度的溶液時(shí)，經(jīng)過80 ℃水浴加熱后對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的樣品提取液相比均呈顯著差異(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比差異均不顯著(P>0.05)；在中等濃度下經(jīng)過水浴加熱后的樣品提取液對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的相比，樂果、甲基對硫磷、丁硫克百威3種農(nóng)藥差異顯著(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比5種農(nóng)藥差異均不顯著(P>0.05)；在高濃度下經(jīng)過水浴加熱后的樣品提取液對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的相比，樂果、甲基對硫磷2種農(nóng)藥差異顯著(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比，樂果、葉蟬散、西維因、丁硫克百威4種農(nóng)藥差異均不顯著(P>0.05)。

表3 五種農(nóng)藥樣品提取液與緩沖液對酶活性抑制率的比較結(jié)果Table 3 Comparison of pesticides detection between the sample solution and buffer solution

洋蔥樣品提取液中分別添加5種農(nóng)藥配制成低濃度的溶液時(shí)，經(jīng)過90 ℃水浴加熱后對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的樣品提取液相比，甲基對硫磷、葉蟬散、西維因、丁硫克百威4種農(nóng)藥呈顯著差異(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比，甲基對硫磷、西維因、丁硫克百威3種農(nóng)藥差異不顯著(P>0.05)；在中等濃度下經(jīng)過水浴加熱后的樣品提取液對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的相比，葉蟬散、西維因2種農(nóng)藥差異顯著(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比，樂果、甲基對硫磷、西維因、丁硫克百威4種農(nóng)藥差異不顯著(P>0.05)；在高濃度下經(jīng)過水浴加熱后的樣品提取液對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的相比，葉蟬散差異顯著(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比，6種農(nóng)藥差異均不顯著(P>0.05)。

大蒜樣品提取液中分別添加5種農(nóng)藥配制成低濃度的溶液時(shí)，經(jīng)過80 ℃水浴加熱后對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的樣品提取液相比，樂果、葉蟬散、西維因、丁硫克百威4種農(nóng)藥呈顯著差異(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比，樂果、葉蟬散、西維因、丁硫克百威4種農(nóng)藥差異不顯著(P>0.05)；在中等濃度下經(jīng)過水浴加熱后的樣品提取液對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的相比，樂果、西維因、丁硫克百威3種農(nóng)藥差異顯著(P<0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比,樂果、葉蟬散、西維因、丁硫克百威4種農(nóng)藥差異不顯著(P>0.05)；在高濃度下經(jīng)過水浴加熱后的樣品提取液對麥麩酯酶的抑制率與未加熱的相比，6種農(nóng)藥差異均不顯著(P>0.05)，而與添加相同質(zhì)量濃度的提取液相比，6種農(nóng)藥差異也均不顯著(P>0.05)。

由以上數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后可知樣品提取液在合適溫度下經(jīng)過水浴加熱可明顯降低其對酶活性抑制作用，使抑制率更接近真實(shí)值。但是，水浴加熱并不能完全保證消除蔬菜中含硫化合物的影響。通過分析還可發(fā)現(xiàn)與上文實(shí)驗(yàn)一致的現(xiàn)象，隨著提取液中濃度的增大，經(jīng)過加熱的樣品提取液與未加熱的提取液對酶活性抑制率的差異逐漸減小。

3 結(jié)論

本研究采用微波處理法和水浴加熱法同時(shí)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)微波加熱法雖然可以在一定程度上減少甚至消除辛辣蔬菜檢測中的假陽性現(xiàn)象，但是在實(shí)際應(yīng)用中存在很大局限性，如辛辣蔬菜的種類不同其質(zhì)地也不同，所以加熱的時(shí)間必須嚴(yán)格控制，否則加熱過度造成蔬菜中汁液流失反而會(huì)增大酶活性抑制率，達(dá)不到消除的效果。并且該方法的效果比水浴加熱法差，而水浴加熱法對香蔥、洋蔥和大蒜假陽性消除情況均可滿足檢測要求，對樣品提取液進(jìn)行加熱可控性好。香蔥、洋蔥、大蒜和青椒的最佳水浴加熱溫度分別為80、90、80、80 ℃，經(jīng)過處理后的樣品提取液對麥麩酯酶活性的抑制率分別由原來的37.06%、20.50%、17.02%、50.34%下降到12.69%、2.95%、5.79%、33.61%。但是2種方法對青椒樣品提取液均不能有效降低其假陽性影響，究其原因是青椒樣品本身含有農(nóng)藥造成假陽性無法消除還是該方法本身不適用青椒，還有待進(jìn)一步研究。