程少波，宋 陽，楊巽喆，馬 嘯，周永紅,3，張海琴,3

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所, 四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院, 四川 成都 611130；3.西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 611130）

多花黑麥草（Lolium multiflorum)，又稱一年生黑麥草、意大利黑麥草，是一種冷季型優(yōu)良牧草，具有生長迅速、產(chǎn)草量高、適口性好、消化率高等特點(diǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在歐洲、亞洲、非洲等世界各地種植[1]。截至2021 年，我國共審定登記一年生黑麥草品種19 個(gè)，其中，育成品種僅5 個(gè)[2]。一年生黑麥草是異花授粉植物，種內(nèi)不同種質(zhì)間會發(fā)生頻繁的基因交流，導(dǎo)致某一品種不同種子之間的基因構(gòu)成可能都不相同[3-4]。隨著國家糧改飼及退耕還林還草政策的全面實(shí)施，我國各大牧區(qū)對優(yōu)良一年生黑麥草種質(zhì)的需求日益增長，但目前市場上銷售的一年生黑麥草品種種子混雜，質(zhì)量較差，品種的一致性也表現(xiàn)較弱，導(dǎo)致農(nóng)牧民難以按照生產(chǎn)需求選擇合適的品種。因此，對一年生黑麥草品種的正確鑒定顯得尤為重要。

牧草品種鑒定主要有形態(tài)學(xué)、物理化學(xué)、生化和DNA 指紋圖譜等不同方法[5]。目前形態(tài)學(xué)鑒定方法主要是DUS 測試鑒定法，主要包括特異性（distinctness)、一致性（uniformity)和穩(wěn)定性（stability)測試[6]，但是DUS 鑒定法存在一定的弊端，測試周期長、耗費(fèi)大量人力和物力且結(jié)果易受環(huán)境影響；DNA 分子標(biāo)記鑒定法從DNA 分子角度鑒別不同品種，多態(tài)性高、操作簡便、鑒定結(jié)果精準(zhǔn)可靠。牧草品種大多來源于野生種馴化和優(yōu)勢品種雜交[7]，SSR 標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、共顯性及多態(tài)性高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于牧草的指紋圖譜構(gòu)建。趙閆閆等[8]利用早熟禾基因組中開發(fā)出來的3 對多態(tài)性SSR引物對18 個(gè)早熟禾（Poa annua)品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建；陳冬明等[9]利用引物EST-SSR750 構(gòu)建了9個(gè)鴨茅（Dactylis glomerata)材料的指紋圖譜；SSR標(biāo)記在一年生黑麥草品種鑒定中得到了廣泛應(yīng)用[10-12]。羅永聰?shù)萚10]從來自一年生黑麥草基因組中的100 對SSR 引物中篩選出12 對引物。這12 對引物多態(tài)性高，其中引物L(fēng)MgSSR15-08C 在多個(gè)品種中具有特征譜帶，這12 對引物將21 份黑麥草分為三大類，可用作構(gòu)建多花黑麥草品種指紋圖譜。

‘川飼1 號’一年生黑麥草新品系由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥族系統(tǒng)學(xué)與資源利用研究團(tuán)隊(duì)通過多親本雜交及多次表型輪回選擇法選育而成。母本群體為來自匈牙利的品種‘Billion’ （‘PI 611146’)，具有葉量豐富、葉片顏色深等特性，在四川成都平原上綜合表現(xiàn)較好。父本群體有4 個(gè)：“杰威”多花黑麥草，植株直立，莖稈粗壯；來自新西蘭的品種‘G.Manawa’ （‘PI 376875’)，越冬性強(qiáng)；來自瑞典的野生材料‘PI 283610’ （分蘗多)和‘PI 283612’ （種子大、千粒重高)。選育方法：5 份親本群體相鄰種植，去除感病、長勢弱、開花特別早或特別晚的不良植株，剩余優(yōu)良植株在自然條件下開放授粉，僅在‘Billion’優(yōu)良植株（母本)上收獲種子。基于產(chǎn)草量、花期及抗病性等性狀進(jìn)行連續(xù)多代輪回選擇，最終獲得性狀穩(wěn)定且綜合表現(xiàn)較優(yōu)的新品系328-4，命名為‘川飼1 號’。該品系于2021 年參加國家草品種區(qū)域試驗(yàn)。為建立‘川飼1 號’新品系的DNA 指紋圖譜，本研究利用SSR 分子標(biāo)記，對‘川飼1 號’及其親本、18 份國審品種構(gòu)建品種間 SSR 分子標(biāo)記指紋圖譜，并篩選新品系特異的SSR 指紋圖譜，用于新品系的快速鑒定，并探討品種間的親緣關(guān)系，以期為新牧草品系的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)及品種資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共23 份一年生黑麥草，包括‘川飼1 號’及其親本，與18 份在全國牧草品種審定委員會登記的國審品種。PI 編號材料由美國國家植物種質(zhì)資源庫 （National Plant Germplasm System，Pullman，Washington，USA) 提供。材料來源信息如表1 所列。

表1 供試材料Table 1 The materials used in this study

1.2 DNA 提取

將種子置于雙層濾紙上發(fā)芽，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d 后選取新鮮的葉片采用改良CTAB 法[13]提取DNA。每個(gè)材料隨機(jī)選取40 株單株葉片等量混合提取DNA。新品系‘川飼1 號’提取2 份DNA（各40 株葉片等量混合，命名為6-1 和6-2)。

1.3 引物合成

本研究選取羅永聰?shù)萚10]從100 對SSR 引物中篩選出的12 對高多態(tài)性引物構(gòu)建一年生黑麥草新品種（系)指紋圖譜。引物由生工生物工程（上海)有限公司合成，引物信息如表2 所列。

表2 12 對SSR 引物序列信息Table 2 Sequence information of 12 pairs of SSR primers

1.4 SSR-PCR 擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，其中PCR-Mix （北京天根生化公司) 10 μL，正、反向引物各0.8 μL （10 pmol·μL-1)，模 板DNA 2 μL （10 ng· μL-1)，Taq DNA聚合酶0.4 μL （2.5 U·μL-1)，ddH2O 補(bǔ)足體積。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；10 個(gè)降落PCR 循環(huán)：94 ℃變性30 s，退火溫度由 65 ℃開始，每個(gè)循環(huán)降低 0.5 ℃，直至60 ℃，退火45 s，72 ℃延伸1 min；30 個(gè)循環(huán)：退火溫度為60 ℃，變性和延伸溫度同上；72 ℃延伸7 min，10 ℃保存。PCR 擴(kuò)增所得產(chǎn)物用ddH2O調(diào)濃度至100 ng·μL-1，然后將樣品上樣至Agilent Fragment Analyzer 上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與聚類分析

用PROSize 3.0 軟件對毛細(xì)管電泳得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。僅統(tǒng)計(jì)每對引物目標(biāo)片段 ± 50 bp范圍內(nèi)的片段（此范圍外的片段為非特異產(chǎn)物)[14]。在相同擴(kuò)增片段上有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，在Excel 表格中將SSR 原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為0/1 矩陣。統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)（total No.of bands, TNB)和多態(tài)性條帶數(shù)量（No.of polymorphic bands, NPB)并計(jì)算多態(tài)性百分率（percentage of polymorphic bands,PPB)。用DataFormater 軟件[15]將SSR 0/1 矩陣轉(zhuǎn)化為Popgene 1.32 軟件的格式，利用該軟件統(tǒng)計(jì)每對引物在23 個(gè)一年生黑麥草材料當(dāng)中的等位基因頻率、香∑ 農(nóng) 信 息 指 數(shù)（Shannon’s information index, I)，I=-Piln(Pi/n)，Pi為第i個(gè)等位變異的頻率，n為檢測到的位點(diǎn)總數(shù)及Nei’s 多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity, H)。利用PIC-CALC 0.6 軟件計(jì)算每個(gè)S co SnRt e位nt,點(diǎn)PI的C)多，P態(tài)IC性=信1-息∑量（p，l o其y m中o rpPhii為s m第i nfio個(gè)r m等a ti位on變異的頻率。采用NTSYS-pc2.10e 軟件計(jì)算Dice 遺傳相似系數(shù)，按UPGMA （unweighted pair group method using arithmetic averages，非加權(quán)成對算術(shù)平均法)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記多態(tài)性分析

12 對SSR 引物對23 份一年生黑麥草品種（系)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共擴(kuò)增出104 條多態(tài)性條帶，12 對引物擴(kuò)增的條帶數(shù)變化范圍為4～14 條，平均每對引物擴(kuò)增出8.667 條帶（表3、圖1)。

多態(tài)性信息量（PIC)是衡量座位多態(tài)性高低程度的指標(biāo)[16-18]。PIC 變化幅度為0.392～0.822，引物L(fēng)MgSSR01-02G 的PIC 最低，為0.392，引物L(fēng)MgSSR 02-12E 的PIC 最高，為0.822，平均多態(tài)性信息含量為0.613 （表3)。

香農(nóng)指數(shù)（I)常用于評估種群遺傳多樣性，數(shù)值越大多樣性越豐富[19-21]。12 對引物香農(nóng)指數(shù)變化范圍為0.911～2.061，平均為1.325。基因多樣性指數(shù)（H)是一個(gè)種群中每個(gè)位點(diǎn)上平均期望雜合度，具有較高H 值的SSR 標(biāo)記具有較高的檢測效率[19]。12 對引物的H 變幅為0.407～0.838，平均基因多樣性指數(shù)為0.650 （表3)。

表3 12 對SSR 引物的多態(tài)性及遺傳多樣性參數(shù)Table 3 The polymorphism and genetic diversity parameters of 12 SSR primers

2.2 聚類分析

UPGMA 聚類分析結(jié)果表明，23 份一年生黑麥草材料在相似系數(shù)0.725 處分為三大支，第一大支包括‘川飼1 號’及其親本供體，其中‘川飼1 號’與品種‘Billion’ （母本)和‘杰威’聚為一小支，2 份野生材料‘PI 283610’、‘PI 283612’及‘G.Manawa’聚為另一小支；第二大支為12 個(gè)國審品種，其中‘川農(nóng)1 號’、‘贛選1 號’、‘阿德納’和‘長江2 號’聚為一個(gè)小支，另外‘贛飼3 號’等8 個(gè)品種聚為另外一小支；第三大支為‘邦德’、‘特高’和‘劍寶’等5 個(gè)品種（圖2)。以上結(jié)果表明：‘川飼1 號’與親本供體（特別是母本)親緣關(guān)系較近，而與其他一年生黑麥草國審品種差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 23 份一年生黑麥草品種(系)SSR 標(biāo)記的UPGMA 聚類圖Figure 2 UPGMA cluster based on SSR markers in 23 varieties of Lolium multiflorum

‘川飼1 號’的2 個(gè)重復(fù)（6-1，6-2)不同引物的所有擴(kuò)增條帶基本一致，遺傳相似系數(shù)高達(dá)93%，表明‘川飼1 號’這一新品系遺傳差異小，為穩(wěn)定的遺傳群體。該結(jié)果同時(shí)也表明本研究的PCR 反應(yīng)體系比較穩(wěn)定，重復(fù)性較好。

2.3 新品系指紋圖譜構(gòu)建

分析‘川飼1 號’新品系與其他品種的SSR 擴(kuò)增條帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：引物L(fēng)MgSSR02-12E 在‘PI 283 610’、‘G.Manawa’和新品系上的238 bp 處有特異條帶，其他國定品種沒有出現(xiàn)該條帶（圖1 箭頭所示)。因此，以上引物可用來構(gòu)建‘川飼1 號’的指紋圖譜，用于新品系的快速鑒定。

圖1 部分SSR 引物毛細(xì)管電泳圖Figure 1 Capillary electrophoresis with partial SSR primers

3 討論與結(jié)論

一年生黑麥草為優(yōu)良牧草，在我國特別是南方地區(qū)廣泛種植。品種種子的質(zhì)量和純度是種子管理的核心工作[22]。由于一年生黑麥草為異花授粉植物，因此市場流通中種子混雜、質(zhì)量較低的現(xiàn)象較為普遍。DNA 指紋圖譜的構(gòu)建是以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)，指紋圖譜多態(tài)性豐富，具有高度的個(gè)體特異性而且不易受環(huán)境影響，同時(shí)相比形態(tài)標(biāo)記的DUS 測試具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，因此指紋圖譜是鑒別品種、品系（含雜交親本、自交系)的有力工具。指紋圖譜主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SNP圖譜等[23]。因SSR 標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好及共顯性的特性，使其成為品種DNA 指紋分析較為理想的技術(shù)[24-27]。劉歡等[28]用30 對EST-SSR 引物中的25 對多態(tài)性引物構(gòu)建了10 個(gè)一年生黑麥草品種的指紋圖譜；蒙宇和王譽(yù)緋[29]用23 對引物對45份多年生黑麥草進(jìn)行遺傳多樣性分析；Nie 等[30]利用SSR 標(biāo)記對6 份四倍體多花黑麥草進(jìn)行遺傳變異性評價(jià)及品種鑒定。本研究選用羅永聰?shù)萚10]從100 對SSR 引物中篩選出的12 對高多態(tài)性引物，對18 份國審多花黑麥草品種進(jìn)行分析并構(gòu)建川飼1 號新品系的SSR 指紋圖譜。12 對SSR 引物均表現(xiàn)出多態(tài)性，且Shannon 信息指數(shù)（I)及多態(tài)性信息含量（PIC)平均值分別為1.325 和0.613。羅永聰?shù)萚10]的研究中平均PIC 為0.843，其中引物L(fēng)MgSSR15-08C的PIC 最高為0.934，而本研究該引物PIC 為0.637。有研究表明引物PIC 與群體遺傳變異程度成正相關(guān)[31]，推測可能部分相同材料發(fā)生了遺傳變異，導(dǎo)致某些特異標(biāo)記的丟失或增加，同時(shí)本研究所用材料與羅永聰?shù)萚10]的研究材料只有12 份一致，剩余11 份材料包括其他國審多花黑麥草品種和新品系‘川飼1 號’及其親本，從而導(dǎo)致本研究引物PIC 值與羅永聰研究不一致。當(dāng)PIC ≥ 0.5，為高度多態(tài)位點(diǎn)，表明這些引物多態(tài)性較高，適宜用于一年生黑麥草品種SSR 指紋圖譜的構(gòu)建。

本研究的分子標(biāo)記結(jié)果可以很好地反映多花黑麥草品種間遺傳多樣性及親緣關(guān)系。部分具有親緣關(guān)系的品種聚為一類，如‘川農(nóng)1 號’和‘贛選1 號’聚為一小支，而‘贛選1 號’是‘川農(nóng)1 號’的親本之一；‘長江2 號’多花黑麥草是以‘阿伯德’和‘贛選1 號’為育種親本材料，進(jìn)行多次混合選育而成，在本研究中，‘贛選1 號’和‘長江2 號’聚為一個(gè)小支，而‘阿伯德’并未聚在同一支上，推測可能是由于‘阿伯德’多花黑麥草在育種過程中的多次混合選擇作用，導(dǎo)致品種群體的特異位點(diǎn)基因頻率發(fā)生改變。羅永聰[10]等研究中的‘特高’和‘杰威’聚類較近，而本研究中的‘特高’則與‘邦德’和‘達(dá)伯瑞’等聚為一支，聚類結(jié)果與Nie 等[30]的研究類似，由于大部分的國審多花黑麥草為引進(jìn)品種很難獲得系譜關(guān)系，加之材料異花授粉的特性，導(dǎo)致難以分析品種間的系譜關(guān)系，但本研究中系譜來源已知的材料聚類結(jié)果與系譜關(guān)系一致。因此，這些SSR 標(biāo)記可以用于多花黑麥草品種的快速鑒定。

‘川飼1 號’是由5 個(gè)親本（‘Billion’、‘杰威’、‘G.Manawa’、‘PI283610’和‘PI 283612’)經(jīng)雜交及輪回選擇選育而來，母本為‘Billion’。本研究利用SSR 分子標(biāo)記鑒定了‘川飼1 號’的來源，聚類結(jié)果表明：新品系‘川飼1 號’與5 個(gè)親本材料聚為一大支，而其他17 份國審品種聚為另外一支，表明‘川飼1 號’與5 個(gè)親本材料親緣關(guān)系較近，而與其他國審品種關(guān)系較遠(yuǎn)。分子結(jié)果與實(shí)際選育過程一致。利用優(yōu)良品種雜交創(chuàng)造變異或從自然群體變異中進(jìn)行優(yōu)良單株選擇是植物新品種選育的重要手段[32]。親本間的遺傳相似性越小，從雜交后代中獲得優(yōu)良單株的機(jī)率就越高，因此，利用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)充分了解親本的遺傳背景為雜交品種和優(yōu)良單株選育提供了參考。

引物L(fēng)MgSSR02-12E 在新品系上擴(kuò)增出大小為238 bp 的特有條帶，其他材料都沒有該帶（圖1)。該引物可用來構(gòu)建‘川飼1 號’的指紋圖譜，用于材料的快速鑒定。