張韓，劉楓，李彥明，姚新亮，魯雪麗

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院 a.心血管內(nèi)科;b.重癥醫(yī)學(xué)科，河南 開(kāi)封 475000)

急性心肌梗死是心血管疾病中發(fā)作極為危急的類型，通常因冠狀動(dòng)脈急性阻塞導(dǎo)致心肌缺血缺氧而發(fā)生壞死。目前，臨床上通常采用再灌注治療急性心肌梗死，但易發(fā)生心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷，影響疾病臨床治療及預(yù)后[1-2]。β-catenin是經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多生命活動(dòng)的調(diào)控[3]。微小RNA-27b(miR-27b)是miRNAs家族成員之一，與多種腫瘤、多種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein 3，BNIP3)是Bcl-2家族成員，在缺血再灌注過(guò)程中通過(guò)介導(dǎo)線粒體自噬影響心肌細(xì)胞損傷[6]，但是如何通過(guò)細(xì)胞通路影響這一過(guò)程不是十分清楚。本研究利用缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌細(xì)胞模型模擬體內(nèi)心肌I/R損傷，探討miR-27b靶向BNIP3對(duì)H/R心肌細(xì)胞β-catenin通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器大鼠H9c2心肌細(xì)胞(貨號(hào)：YBCC337726)購(gòu)自美國(guó)ScienCell；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：KL-P0032)購(gòu)自德國(guó)merck/sigma公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào)：11668019)購(gòu)自Invitrogen公司；CCK-8試劑、BNIP3抗體、軸抑制因子1(Axin1)抗體、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體、GAPDH抗體(貨號(hào)：ab228554、ab219609、ab233652、ab32572、ab181602)購(gòu)自美國(guó)abcam公司；熒光定量PCR試劑盒、無(wú)序siRNA、miR-27b siRNA均由生工生物工程有限公司合成。恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購(gòu)自日本松下公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：ABI 7500)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：MODEL550)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，2～3 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。

1.2.2H/R模型建立及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞以每瓶2×105個(gè)接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，棄上清液，換DMEM無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基，置于抽氣型厭氧罐(先將罐中空氣抽凈在注入體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、94% N2、1% O2混合氣體)于37 ℃密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，即缺氧處理。棄上清液，換含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于正常氧濃度(體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、95%空氣混合)的培養(yǎng)中培養(yǎng)3 h，即復(fù)氧處理。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組(H9c2細(xì)胞正常培養(yǎng))、H/R組(H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理)、H/R+NC組(H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染無(wú)序siRNA后經(jīng)H/R處理)和H/R+miR-27b siRNA組(H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27b siRNA后經(jīng)H/R處理)。H/R+NC組和H/R+miR-27b siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3mRNA表達(dá)情況 將H9c2細(xì)胞按照1.2.2分組處理后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-27b、BNIP3mRNA表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)閁6、β-actin。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)40次；72 ℃ 10 min。miR-27b上游引物：5’-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，下游引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；BNIP3 mRNA上游引物：5’-GTCGCAGAGCGGGGAGGAGA-3’，下游引物：5’-TCTGGGAGCGAGGTGGGCTG-3’；內(nèi)參U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；內(nèi)參β-actin上游引物：5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’，下游引物：5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3’。Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到臨界閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，miR-27b、BNIP3mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法表示。

1.2.4蛋白印跡(western blot，WB)法檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞中BNIP3、β-catenin蛋白表達(dá)情況 將H9c2細(xì)胞按照1.2.2分組處理后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PDVF膜上，用含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入BNIP3抗體、β-catenin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值。

2 結(jié)果

2.1 各組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3mRNA表達(dá)情況H/R組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)；H/R組與H/R+NC組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；H/R+miR-27b siRNA組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3mRNA表達(dá)水平低于H/R組和H/R+NC組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各組H9c2細(xì)胞中BNIP3、β-catenin蛋白表達(dá)情況H/R組H9c2細(xì)胞中BNIP3、β-catenin蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(P<0.05)；H/R組與H/R+NC組H9c2細(xì)胞中BNIP3、β-catenin蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；H/R+miR-27b siRNA組H9c2細(xì)胞中BNIP3蛋白表達(dá)水平低于H/R組和H/R+NC組(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)水平高于H/R組和H/R+NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組H9c2細(xì)胞中BNIP3、β-catenin蛋白表達(dá)情況

表2 各組H9c2細(xì)胞中BNIP3、β-catenin蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

心臟是重要的功能器官，向器官、組織提供充足的血流量，通過(guò)推動(dòng)血液流動(dòng)運(yùn)送氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝終產(chǎn)物，維持細(xì)胞正常的功能。目前，心血管疾病是威脅人類健康的重大疾病之一，平均每年死于心血管疾病的人數(shù)高達(dá)1 790萬(wàn)人，占死亡總數(shù)的31%[7]。臨床上治療急性心血管疾病通常采用再灌注，該治療過(guò)程中引起的氧化應(yīng)激和炎癥損傷會(huì)導(dǎo)致缺血心肌組織進(jìn)一步受損，影響心肌功能恢復(fù)[8]。I/R誘導(dǎo)的心肌損傷是一個(gè)復(fù)雜的、多因素的病理生理過(guò)程，伴隨著心肌細(xì)胞的壞死、凋亡及自噬。而心肌細(xì)胞H/R可在一定程度上與心肌I/R損傷過(guò)程類似，常用來(lái)模擬心肌I/R損傷過(guò)程。

miR-27b是microRNA家族重要成員，在心臟疾病發(fā)生過(guò)程中起重要作用。劉剛等[9]研究表明，抑制miR-27b表達(dá)可降低病毒性心肌炎心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡率。Liang等[10]研究表明，miR-27b與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過(guò)程有關(guān)。BNIP3屬于Bcl-2家族蛋白，其BH3結(jié)構(gòu)域能與抗凋亡蛋白形成異二聚體，抑制后者的抗凋亡作用，從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡過(guò)程[11]。劉鼎乾等[12]研究表明，BNIP3在大鼠心肌缺血再灌注過(guò)程中介導(dǎo)線粒體自噬，清除損傷的線粒體，對(duì)防止活性氧大量釋放、激活細(xì)胞死亡通路有重要作用。本研究結(jié)果顯示，H/R組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組，推測(cè)miR-27b、BNIP3參與H9c2細(xì)胞H/R損傷過(guò)程。

β-catenin通路是與細(xì)胞增殖、分化、凋亡有關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路，主要通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin活化，進(jìn)而控制通路下游基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，在肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮改善氧化應(yīng)激損傷、減輕炎癥免疫應(yīng)答、減少細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬等作用[13]。鄧榮榮等[14]研究表明，腎衰康灌腸液含藥血清可能通過(guò)激活β-catenin通路抑制H/R損傷腎小管上皮細(xì)胞的凋亡/死亡過(guò)程。自噬在缺血-再灌注過(guò)程中的作用是一把“雙刃劍”，早期可能通過(guò)減少能量消耗、清除受損細(xì)胞器來(lái)恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，后期過(guò)度激活導(dǎo)致細(xì)胞器絕對(duì)數(shù)目減少，能量供給不足，加重細(xì)胞損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，H/R組H9c2細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明H9c2細(xì)胞H/R處理后β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到抑制。

本研究對(duì) miR-27b在H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理后的作用進(jìn)行分析，結(jié)果顯示H/R+miR-27b siRNA組H9c2細(xì)胞中miR-27b、BNIP3mRNA表達(dá)水平、BNIP3蛋白表達(dá)水平低于H/R組、H/R+NC組，β-catenin蛋白表達(dá)水平高于H/R組、H/R+NC組，提示抑制H9c2細(xì)胞中miR-27b表達(dá)后，BNIP3轉(zhuǎn)錄、翻譯水平隨之降低，β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。BNIP3作為凋亡因子，與β-catenin通路共同在心肌細(xì)胞缺氧損傷中發(fā)揮作用，在心肌缺血灌注過(guò)程中介導(dǎo)線粒體自噬[12,16]。本研究中，miR-27b可能通過(guò)調(diào)控BNIP3途徑影響H/R心肌細(xì)胞β-catenin通路的調(diào)控。

綜上所述，miR-27b可通過(guò)調(diào)控BNIP3對(duì)H/R心肌細(xì)胞β-catenin通路產(chǎn)生一定影響，即沉默miR-27b表達(dá)后可抑制BNIP3轉(zhuǎn)錄、翻譯水平，激活β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而影響細(xì)胞的自噬。但考慮到β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及自噬作用的復(fù)雜性，還需進(jìn)一步研究其與miR-27b、BNIP3間的具體作用關(guān)系，以期為臨床治療中減少心肌I/R損傷提供幫助。