陳園園，李鋒，魏佳韻，李香豫，王丹， 燕瑾，王優(yōu)美，3，徐鵬，3**，狄斌**

（1.中國(guó)藥科大學(xué)，南京 210009； 2.國(guó)家禁毒委員會(huì)辦公室中國(guó)藥科大學(xué)禁毒關(guān)鍵 技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3.毒品監(jiān)測(cè)管控與禁毒關(guān)鍵技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心，北京 100193）

海洛因是濫用較早并且較為廣泛的毒品之一。據(jù)《2019 年全球毒品報(bào)告》稱，海洛因是南亞2016 年在10～75 歲人口中濫用最普遍的阿片類物質(zhì)。在美國(guó)，2016 年吸食海洛因的人口為90 萬，約占12 歲以上總?cè)丝诘?.3%[1]。每年因吸食海洛因而致死人數(shù)不容忽視，據(jù)美國(guó)疾病控制中心統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)從2013 年以來每年因吸食海洛因致死的人數(shù)呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，并且在2017 年的致死人數(shù)達(dá)到了15 482[2]。因此加強(qiáng)對(duì)海洛因毒性的研究存在其必要性并且也可為對(duì)中毒患者的解救方法提供可能的新的研究方向。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的信息傳遞物質(zhì)，主要包括多巴胺（DA）、5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素等。盡管單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在藥物成癮過程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[3-4]，但值得注意的是，這類物質(zhì)在毒品中毒過程中的影響近年來已引起相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。有研究表明長(zhǎng)期吸食毒品會(huì)對(duì)腦內(nèi)不同腦區(qū)產(chǎn)生神經(jīng)損傷[5-6]，并且有多項(xiàng)研究表明在長(zhǎng)期給予海洛因后，大鼠特定腦區(qū)的DA 含量在升高后會(huì)逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因可能主要與神經(jīng)損傷有關(guān)[7-8]。有文獻(xiàn)稱阿片類物質(zhì)比興奮劑毒性更強(qiáng)，阿片類物質(zhì)如海洛因其毒性主要與腦內(nèi)DA 及其代謝物濃度有關(guān)[9]。而2016 年3 月，美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）發(fā)布了《藥品安全通訊》，內(nèi)容涉及多種阿片類鎮(zhèn)痛藥物與5-HT 毒性的關(guān)系[10]。

目前我國(guó)還沒有開展海洛因急性中毒與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)之間關(guān)系的研究。本文通過建立并應(yīng)用HPLC-ECD方法，首次對(duì)海洛因急性中毒大鼠伏隔核和紋狀體兩個(gè)腦區(qū)中的DA 和5-HT 含量同時(shí)進(jìn)行了定量分析研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

HPLC-ECD，Antec Scientific 公司（檢測(cè)器型號(hào)為DECADE Elite，自動(dòng)進(jìn)樣器型號(hào)為AS 110，泵型號(hào)為AZURA P 6.1L）；3K15 型高速冷凍離心機(jī)（Sigma 公 司）；XS105DU 型電子分析天平（METTER-TOLEDO公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Merck 公司）。DA、5-HT標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma 公司）；磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；辛烷磺酸鈉（色譜純，北京百威靈科技有限公 司）；高氯酸（分析純，天津市鑫源化工有限公司）；乙腈（色譜純，Merck 公司）；海洛因由公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心提供，純度為85%。

1.2 色譜條件

色譜柱：QUATTRO，C18反相色譜柱（2.1 mm× 150 mm, 3 μm）；流動(dòng)相：磷酸二氫鈉-檸檬酸-辛烷磺酸鈉緩沖體系（90 mmol/L 二水合磷酸二氫鈉， 50 mmol/L 一水合檸檬酸，1.7 mmol/L 一水合辛烷磺酸鈉，0.05 mmol/L 二水合乙二胺四乙酸二鈉）∶乙腈（94 ∶6, V/V），使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜負(fù)壓濾過，并超聲脫氣20 分鐘；流動(dòng)相流速為0.3 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl，柱溫為35 ℃；電化學(xué)檢測(cè)器工作電極為玻璃碳電極，參比電極為銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極，工作電壓為0.8 V，靈敏度為10 nA。

1.3 組織裂解提取液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

組織裂解提取液為0.10 mmol/L 高氯酸、0.20 mmol/L二水合乙二胺四乙酸二鈉、0.01%（W/V）L-半胱氨酸的混合水溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用組織裂解提取液配制濃度為0.5 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中保存。使用時(shí)用組織裂解提取液將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋至所需要的線性最大濃度，再逐級(jí)稀釋至所需濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ICR 小鼠，18～22 g；雄性Sprague-Dawley 大 鼠，體重280～360 g。均購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。

1.5 通過上下法計(jì)算海洛因小鼠皮下給藥的半數(shù)致死量（LD50）

在AOT425 StatPgm 軟件的指示下進(jìn)行逐只給藥，根據(jù)每只小鼠的陽性（死）或者陰性（活）情況決定下一只小鼠的給藥劑量，最終通過對(duì)結(jié)果的計(jì)算得到小鼠皮下給藥海洛因的LD50及95%置信區(qū)間。

1.6 海洛因中毒大鼠不同腦區(qū)腦勻漿的制備

將小鼠皮下給藥所得的海洛因LD50數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥換算表換算成大鼠皮下給藥海洛因的，設(shè)置生理鹽水對(duì)照組、1/2 大鼠LD50劑量海洛因組和大鼠LD50劑量海洛因組，每組6 只大鼠，皮下給藥1 小時(shí)后處死，大鼠處死后迅速斷頭，剝?nèi)∪X，擦去表面血跡后放置于-20 ℃冰箱冷凍，30 分鐘后取出，然后參照大鼠腦立體定位圖譜，冰臺(tái)上迅速分離紋狀體、伏隔核腦組織，分別精確稱重，每0.01 g 腦組織（濕重）加入1 ml 組織裂解提取液，冰浴下勻漿，高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min 4 ℃離心20 分鐘，取上清液用 0.20 μm 濾膜過濾后進(jìn)行HPLC-ECD 檢測(cè)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過AOT425 StatPgm 軟件計(jì)算得到小鼠皮下給藥海洛因的LD50以及95%置信區(qū)間。通過GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間通過單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行比較，P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 專屬性

DA、5-HT 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖、腦勻漿樣品色譜圖分別見圖1-A 和圖1-B， 保留時(shí)間分別為7.358 和17.175 分鐘。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）及大鼠腦組織勻漿樣本（B）色譜圖

2.2 線性范圍

由于腦組織樣本中本身含有所測(cè)物質(zhì)，故無空白樣本。本實(shí)驗(yàn)用組織裂解提取液將DA、5-HT 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度，DA：0.5, 2, 8, 32, 64, 128 ng/ml；5-HT：0.5, 1, 2, 4, 8, 16 ng/ml。采用外標(biāo)法定量，以樣品峰面積（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，以上物質(zhì)在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為：

DA：Y=0.582 63X-0.011 8 r2=0.999

5-HT：Y=0.643 79X-0.113 99 r2=0.999

2.3 檢測(cè)限和定量限

按3 倍信噪比計(jì)算最低檢測(cè)限；按10 倍信噪比計(jì)算最低定量限。DA 和5-HT 的最低檢測(cè)限均為0.2 ng/ml；最低定量限均為0.5 ng/ml。

2.4 精密度

配制低、中、高3 種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，同一天內(nèi)每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算峰面積的RSD，測(cè)得日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算峰面積的RSD，測(cè)得日間精密度[12]。日內(nèi)、日間精密度均小于5%，表明本方法精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 DA、5-HT 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液日內(nèi)、 日間精密度（n=5）

2.5 準(zhǔn)確度

按0.01 g 腦組織（濕重）加入1.0 ml 組織裂解提取液的比例分別將10 只大鼠的伏隔核和紋狀體組織混合勻漿，作為回收率試驗(yàn)用樣品，然后不同組織勻漿液分別取出三份按照樣品處理方法操作后進(jìn)樣分析，求出兩種勻漿液中DA 和5-HT 的平均含量作為空白值，然后取同量上述勻漿液分別加入低、中、高3 種濃度的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平分6 份，按照樣品處理方法操作后進(jìn)樣分析，將加入對(duì)照品溶液后測(cè)得的濃度減去空白值，與對(duì)照品比較計(jì)算伏隔核和紋狀體中DA 和5-HT 的回收率[13]。不同腦區(qū)DA 和5-HT 回收率均在80%～120%以內(nèi)，回收率良好。結(jié)果見表2。

2.6 穩(wěn)定性

樣品處理方法與加樣回收率實(shí)驗(yàn)相同，將處理好的樣品于4 ℃存放，于0、1、2 和4 天進(jìn)樣分析，得穩(wěn)定性結(jié)果。結(jié)果表明，處理好的樣品4 天內(nèi)于4 ℃存放，各組分含量無明顯降低，穩(wěn)定性良好。結(jié)果見 表3。

表表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 腦組織勻漿提取液4 天內(nèi)穩(wěn)定性結(jié)果（n=4）

2.7 小鼠及大鼠皮下給藥LD50 結(jié)果

由AOT425 StatPgm 軟件計(jì)算可得，通過皮下注射給藥方式的小鼠海洛因LD50為281 mg/kg，95%置信區(qū)間為231～300 mg/kg。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥換算表換算得到大鼠皮下給藥海洛因LD50為197 mg/kg，取值為200 mg/kg，并取大鼠皮下給藥海洛因LD50劑量的1/2，即為100 mg/kg，根據(jù)此結(jié)果設(shè)置生理鹽水對(duì)照組、1/2 大鼠LD50劑量海洛因組和大鼠LD50劑量海洛 因組。

2.8 大鼠皮下給藥海洛因1 小時(shí)后不同腦區(qū)中DA和5-HT 含量變化

大鼠通過皮下注射給藥方給予不同劑量海洛因 1 小時(shí)后，伏隔核和紋狀體中的DA 和5-HT 含量產(chǎn)生了不同程度的變化。與生理鹽水組相比，大鼠伏隔核和紋狀體中DA 含量無論是給予大鼠海洛因LD50劑量，還是1/2 大鼠海洛因LD50劑量，在1 小時(shí)后都沒有顯著性差異，而5-HT 含量在給予兩個(gè)劑量海洛因 1 小時(shí)后，在伏隔核[F(2, 18)=31.59, P＜0.000 1]和紋狀體[F(2, 18) =17.65, P＜0.000 1]兩個(gè)腦區(qū)均發(fā)生了顯著性升高(P＜0.01, P＜0.001)，且呈劑量依賴性變化。結(jié)果見 表5。

表5 大鼠皮下給藥海洛因1 小時(shí)后不同腦區(qū)單胺類神經(jīng) 遞質(zhì)含量變化（n=6～9，±s）

表5 大鼠皮下給藥海洛因1 小時(shí)后不同腦區(qū)單胺類神經(jīng) 遞質(zhì)含量變化（n=6～9，±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與生理鹽水對(duì)比。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量/（ng/0.01 g）腦區(qū) 給藥劑量/（mg/kg）DA 5-HT生理鹽水 59.95±3.96 2.68±0.36 100 58.79±7.04 10.12±1.36**200 61.63±5.30 17.73±2.38***生理鹽水 70.28±7.21 1.53±0.24 100 111.60±16.82 12.08±2.50**200 94.20±16.99 18.34±3.45***伏隔核紋狀體

3 討論

海洛因的毒性通常與其作用機(jī)制有關(guān)。邱平明 等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)長(zhǎng)期給予海洛因建立成癮模型的大鼠紋狀體中DA 含量沒有升高反而發(fā)生下降，其原因可能與長(zhǎng)期給藥致使紋狀體發(fā)生功能損壞有關(guān)。同時(shí)有研究表明DA 對(duì)DA 能神經(jīng)元有毒性作用，其機(jī)制可能是由其自身氧化產(chǎn)生的自由基引起[16]，還有文獻(xiàn)稱阿片類物質(zhì)毒性與腦內(nèi)DA 及其代謝物濃度有關(guān)，它會(huì)促使DA 濃度升高后翻轉(zhuǎn)下降，引起細(xì)胞氧化損傷甚至死亡，其原因是DA 的代謝會(huì)產(chǎn)生過氧化氫（H2O2）并通過一系列反應(yīng)產(chǎn)生活性氧自由基，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害，DA 同時(shí)還會(huì)抑制線粒體的呼吸作用[9]。因此在長(zhǎng)期給予海洛因后可能會(huì)使DA 含量一直處于較高水平而導(dǎo)致DA 能神經(jīng)較為密集的腦區(qū)產(chǎn)生一定程度的 損傷。

單次吸食海洛因過量致死的原因常常是呼吸抑 制[14]，其急性毒性與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的機(jī)制研究則較少。有研究表明海洛因可以較強(qiáng)地激動(dòng)DA 能神經(jīng)，而5-HT能神經(jīng)只有大劑量作用下才會(huì)被激動(dòng)[15]。5-HT 濃度過高常常會(huì)導(dǎo)致5-HT 毒性的產(chǎn)生，阿片類鎮(zhèn)痛藥物多因其能抑制5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體再攝取與5-HT 毒性相關(guān)[17]。

值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)：在海洛因單次急性給藥實(shí)驗(yàn)中，給藥1 小時(shí)后給藥組兩個(gè)腦區(qū)中的DA 含量與生理鹽水組相比較，均沒有顯著性差異，而5-HT 含量則有顯著性升高，且與給藥劑量呈正相關(guān)，其含量是生理鹽水組的4～20 倍，極可能產(chǎn)生了5-HT 毒性。因此在急性中毒劑量海洛因的作用下，海洛因毒性是否與此時(shí)產(chǎn)生的高濃度5-HT 毒性有關(guān)值得引起關(guān)注。

海洛因的中毒致死可能與DA 和5-HT 含量變化存在某些關(guān)聯(lián)，但是由于缺乏與海洛因相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)毒性致死的文獻(xiàn)，且由于本實(shí)驗(yàn)只設(shè)定了給藥1 小時(shí)后這一個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及未能進(jìn)行更有針對(duì)性的機(jī)制研究，該類神經(jīng)遞質(zhì)在阿片類物質(zhì)急性中毒中的具體毒性機(jī)制還有待于后續(xù)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本文采用高效液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測(cè)器建立了準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定的同時(shí)測(cè)定大鼠不同腦區(qū)中DA和5-HT的實(shí)驗(yàn)方法，并對(duì)海洛因中毒大鼠伏隔核和紋狀體腦區(qū)中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化進(jìn)行了測(cè)定。首次發(fā)現(xiàn)海洛因急性中毒可劑量賴性的顯著升高大鼠伏隔核和紋狀體腦區(qū)內(nèi)的5-HT 水平，其急性毒性作用的主要靶點(diǎn)可能與大鼠腦內(nèi)的5-HT 系統(tǒng)有關(guān)。