陳亮，田飛豹，辛秀蘭，蘭蓉，于然，吳志明，梁浩，3

（1 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京100176；2 北京化工大學(xué)化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100029；3 北京化工大學(xué)秦皇島環(huán)渤海生物產(chǎn)業(yè)研究院，河北秦皇島066000）

核黃素，別名維生素B2，是維生素B族的重要組成部分，其前身為維生素G，分子式為C17H20N4O6，分子量376.37，CAS 號(hào)為83-88-5，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)其命名為7,8-二甲基-10(1’-D-核糖醇基)-異咯嗪[1]，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 核黃素結(jié)構(gòu)式

核黃素是生物體內(nèi)黃素的主要來(lái)源，其衍生物黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是大多數(shù)黃素輔酶不可或缺的活性基團(tuán)。這些黃素輔酶在體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白折疊、DNA 修復(fù)、脂肪酸β-氧化、氨基酸氧化和膽堿代謝等生理功能方面發(fā)揮著重要的作用[2-7]。研究發(fā)現(xiàn)，核黃素可以改善不同疾病常規(guī)治療的效率[8-10]、發(fā)揮保護(hù)組織免受氧化損傷[11-13]等輔助功效。美國(guó)食品營(yíng)養(yǎng)委員會(huì)推薦成人每日攝取核黃素的劑量是0.9～1.3mg。其不僅被廣泛應(yīng)用于臨床中，而且由于其無(wú)毒害并顏色呈黃色，也經(jīng)常作為營(yíng)養(yǎng)添加劑和色素應(yīng)用在食品工業(yè)中[14]。核黃素是進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)上較早的幾個(gè)維生素之一，國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用、保健、抗衰老類制劑超過(guò)二百多種，由于食品工業(yè)、保健品及營(yíng)養(yǎng)添加劑工業(yè)的快速發(fā)展，市場(chǎng)對(duì)核黃素的需求也將不斷上升。

核黃素的晶習(xí)一般分為三種，即針狀、粉末狀和塊狀。目前大多數(shù)是針狀的結(jié)晶體，但是其堆密度小，流動(dòng)性能差，加工性能差，處理難度大，最終會(huì)影響壓片等加工性能。Saprykin 等[15]研究表明可以通過(guò)使用膠黏劑來(lái)提高核黃素的加工性能，然后使用硫化床進(jìn)行噴霧干燥從而提高流動(dòng)性能，但是這種方法過(guò)程繁雜，成本也會(huì)增高。溶液結(jié)晶經(jīng)常被用于有機(jī)可溶性物質(zhì)以及無(wú)機(jī)鹽的分離純化，溶液結(jié)晶不僅可以把溶質(zhì)轉(zhuǎn)變成固體從溶液中分離，而且還被廣泛應(yīng)用于晶體物質(zhì)的純化。當(dāng)超聲波被施加到溶液中的介質(zhì)時(shí)，不僅可以使介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速度加快，而且還能產(chǎn)生聲空化作用。液體溶液在超聲波的作用下會(huì)形成局部的負(fù)壓區(qū)，在負(fù)壓區(qū)中介質(zhì)分子比較稀疏、離散，密度減少?gòu)亩纬煽栈瘹馀?，?jīng)過(guò)超聲波的正負(fù)交變，也會(huì)產(chǎn)生正壓區(qū)，在正壓區(qū)會(huì)使介質(zhì)密度增大。當(dāng)超聲波作用足夠強(qiáng)大時(shí)，就會(huì)使氣泡被壓縮，從而使氣泡體積減小，當(dāng)超過(guò)氣泡的承受能力后，空化氣泡就變得不穩(wěn)定，從而潰陷并逐步消失。超聲結(jié)晶方法被認(rèn)為是作為實(shí)現(xiàn)更快及均勻形成初級(jí)成核，并能在較低的過(guò)飽和水平下相對(duì)容易成核，來(lái)減少晶體結(jié)塊的一個(gè)有效途徑，能夠顯著地改善產(chǎn)品的工藝和物理特性[16]。因此，本文對(duì)核黃素超聲輔助結(jié)晶進(jìn)行研究，包括結(jié)晶方法的篩選、超聲輔助條件的優(yōu)化并進(jìn)行產(chǎn)品表征。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

核黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）和核黃素粗品（飼料級(jí)，80%），赤峰制藥廠；鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉，均為分析純，北京試劑廠；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

紫外分光光度計(jì)，UV-2450，日本島津公司；電子天平，Sartorius-BT25s，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，Biosafer 3D，寧波生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡，BME，LEICA；電子顯微鏡，H-800，日本日立公司。

1.2 核黃素含量測(cè)定

1.2.1 核黃素的光譜掃描[17]

稱取核黃素標(biāo)準(zhǔn)品15.0mg，加入5mL 0.25%冰乙酸溶液，加熱攪拌使核黃素充分溶解。隨后轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶定容。取10mL 上述溶液，再用5mL 0.25%冰乙酸溶液定容至100mL，用蒸餾水作為空白，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，選擇444nm作為測(cè)量核黃素的波長(zhǎng)。

1.2.2 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取10mg 核黃素，加入0.25%冰乙酸溶液，加熱溶解后用去離子水定容到100mL。取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL、12.5mL、15mL，分別用0.25% 冰乙酸溶液定容到50mL，并在444nm處測(cè)定其吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度值Y 與濃度x 建立回歸方程Y=28.354x+0.0138，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，其在0.005～0.03mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.2.3 核黃素純度測(cè)定

準(zhǔn)確稱量核黃素樣品少許，加入0.25%冰乙酸溶液稀釋，在444nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出核黃素純度（%）。

1.3 結(jié)晶方法的篩選[18-20]

1.3.1 溶劑析出法

稱取2.0g 核黃素粗品，加入10mL 36%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）濃鹽酸溶解，在50℃條件下以300r/min的轉(zhuǎn)速加熱攪拌30min，然后加入200mL 90℃水，95℃繼續(xù)加熱2h，自然冷卻至室溫，抽濾，記錄濾液體積并測(cè)量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.2 溶劑析出結(jié)合酸溶法

稱取2.0g 核黃素粗品，加入16mL 23.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽酸溶液溶解，在30℃條件下以300r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30min，加入40mL 水，抽濾，記錄濾液體積并測(cè)量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.3 控制結(jié)晶法

稱取核黃素粗品2.0g，用120mL 水溶解，在80℃條件下加熱回流30min，然后升溫至100℃加熱回流1h，降溫至30℃，抽濾，用40mL 40℃水沖洗，再用40mL 甲醇沖洗，記錄濾液體積并測(cè)量濾液中核黃素的濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.4 酸溶法

稱取核黃素粗品2.0g，加入60mL 0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽酸溶液，在80℃條件下加熱回流30min，迅速冷卻至室溫，抽濾，記錄濾液體積并測(cè)量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.5 堿溶法

稱取核黃素粗品2.0g，加入40mL pH 為12 的氫氧化鈉溶液進(jìn)行溶解，過(guò)濾，濾液邊攪拌邊加入0.2%～0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）雙氧水20mL，攪拌1h，然后加酸調(diào)節(jié)pH 至4，抽濾，記錄濾液體積并測(cè)量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

經(jīng)上述方法處理后，樣品稱重，測(cè)定收率（%）和純度（%），計(jì)算出綜合效益（%）。綜合效益（%）=收率×純度×100%。

1.4 結(jié)晶影響因素的探討

采用對(duì)比5種不同結(jié)晶純化方法，根據(jù)綜合效益篩選出最好的方法是酸溶法，在此基礎(chǔ)上加入超聲波作用，進(jìn)一步探討超聲時(shí)間、功率和溫度對(duì)核黃素的純度、收率以及結(jié)晶度和晶習(xí)等方面的影響。

分別稱取核黃素粗品2.0g，加入60mL 0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽酸溶液，80℃條件下加熱回流30min，迅速冷卻至室溫，接著分別在不同時(shí)間（15min、 25min、 40min）、 不 同 功 率（200W、400W、500W）以及不同溫度（30℃、40℃、50℃）這3 個(gè)參數(shù)變量條件下進(jìn)行超聲處理，冷卻至30℃，抽濾，水洗，甲醇洗，記錄濾液體積并測(cè)量核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品，計(jì)算收率、純度和綜合效益。

1.5 核黃素超聲結(jié)晶后的表征分析

分別采用光學(xué)顯微鏡、投射電子顯微鏡及X射線衍射（XRD）對(duì)超聲輔助結(jié)晶純化的核黃素以及未進(jìn)行超聲輔助的核黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

1.5.1 光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)

分別取超聲輔助結(jié)晶及未超聲輔助結(jié)晶的核黃素樣品各10mg溶于1mL鹽酸-乙醇溶液中，混合均勻，各取1滴于載玻片及300 目銅網(wǎng)上，在載玻片上覆蓋潔凈的蓋玻片，編號(hào)標(biāo)記，使用光學(xué)顯微鏡及電鏡觀察結(jié)構(gòu)。

1.5.2 XRD分析晶型

分別取超聲輔助結(jié)晶及未超聲輔助結(jié)晶的核黃素樣品于80℃下干燥2h，研成粉末，各取少許于XRD 載物臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算結(jié)晶度（%）。結(jié)晶度（%）=非晶峰的積分強(qiáng)度/（非晶峰的積分強(qiáng)度+結(jié)晶部分的積分強(qiáng)度）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶方法的篩選

表1 列出了5 種核黃素結(jié)晶方法純化后的結(jié)果，溶劑析出法是基于被分離組分與溶劑分子間相互作用力的差異，本實(shí)驗(yàn)中以鹽酸作為溶劑，以水作為析出劑，結(jié)晶時(shí)間長(zhǎng)，影響因素較多不易控制；溶劑析出結(jié)合酸溶法綜合效益相對(duì)溶劑析出法好；控制結(jié)晶法是以水作為溶劑，操作復(fù)雜，用時(shí)較長(zhǎng)；酸溶法以鹽酸為溶劑，溶解核黃素，最后結(jié)晶，操作簡(jiǎn)便，用時(shí)較短；堿溶法利用核黃素在堿性條件下溶解度大，但核黃素在堿溶液中易分解，同時(shí)需要經(jīng)雙氧水氧化，操作復(fù)雜且用時(shí)較長(zhǎng)。因此，在5種結(jié)晶純化方法中，酸溶法耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、綜合效益最高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用酸溶法進(jìn)行研究。

2.2 結(jié)晶影響因素的探討

傳統(tǒng)的結(jié)晶方法中由于晶體生長(zhǎng)過(guò)程的復(fù)雜性，在晶體成形的過(guò)程中伴隨著溶液過(guò)飽和、成核、晶體生長(zhǎng)和集聚，因此產(chǎn)品工業(yè)中試放大面臨著極大的挑戰(zhàn)。但是當(dāng)超聲引入溶液結(jié)晶，可以極大地改進(jìn)結(jié)晶過(guò)程，改善核黃素晶體形狀，使粒度分布均勻[16,21-23]，故實(shí)驗(yàn)通過(guò)在核黃素酸溶法結(jié)晶的基礎(chǔ)上添加超聲波，探索其對(duì)于結(jié)晶效果的影響。

表1 5種核黃素結(jié)晶方法的收率和純度

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)超聲結(jié)晶純度與收率的影響

在結(jié)晶純化方法中加入超聲輔助作用，在不用超聲時(shí)間條件下，所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲作用時(shí)間對(duì)結(jié)晶純度和收率的影響

由圖2所知，功率一定時(shí)，其純度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)有所增長(zhǎng)，但增幅不大，綜合效益隨超聲時(shí)間的增加而增加，故選擇超聲時(shí)間為40min。核黃素成核結(jié)晶需要一個(gè)誘導(dǎo)成核達(dá)平衡的過(guò)程，40min 結(jié)晶達(dá)到平衡穩(wěn)定，故結(jié)晶的綜合效益最高。同時(shí)，超聲波可以降低溶液的過(guò)飽和濃度，晶體的成核生長(zhǎng)速率也會(huì)隨著溶液過(guò)飽和濃度的降低隨之增加。因此，超聲作用也加速了溶質(zhì)分子從溶液到晶體表面的傳遞速率，縮短誘導(dǎo)期，提升了結(jié)晶的速度[24]。

2.2.2 超聲功率對(duì)超聲結(jié)晶純度與收率的影響

在結(jié)晶純化方法中加入超聲輔助作用，在不用超聲功率下，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3 所知，隨著超聲功率的增大，其純度有先增大后減小的趨勢(shì)?？傮w來(lái)看，在功率為400W 時(shí)，超聲輔助酸溶結(jié)晶的綜合效益最高。溶質(zhì)分子從溶液擴(kuò)散到晶體表面，然后進(jìn)入晶格，超聲作用促進(jìn)了擴(kuò)散速率，使得成核時(shí)間降低，并增加了晶核的數(shù)量。杭方學(xué)等[25]采用超聲處理研究溶析晶體時(shí)發(fā)現(xiàn)，在超聲功率400W 以下時(shí)，超聲波的功率越大，擴(kuò)散系數(shù)越大，促進(jìn)了分子間的混合，增強(qiáng)了不同相間的熱質(zhì)傳遞，結(jié)晶成核速率也越高。但是在高功率400W 以上，超聲功率過(guò)大，導(dǎo)致產(chǎn)生晶體粒度過(guò)小，容易聚結(jié)，雜質(zhì)進(jìn)入結(jié)晶體里面，造成純度下降，純化的綜合效益降低[26]。

圖3 超聲功率對(duì)結(jié)晶純度和收率的影響

2.2.3 超聲溫度對(duì)超聲結(jié)晶純度與收率的影響

通過(guò)改變超聲溫度，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲溫度對(duì)結(jié)晶純度和收率的影響

由圖4 得知，當(dāng)超聲功率和時(shí)間一定時(shí)，隨著超聲溫度的升高，收率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于隨著超聲溫度的升高，核黃素的溶解度增加，使得析出的晶體減少，故收率有所下降；而對(duì)于純度來(lái)說(shuō)，隨著超聲溫度升高，溶質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加快，結(jié)晶速度減慢，雜質(zhì)不易進(jìn)入晶體中，同時(shí)“空化”作用產(chǎn)生的氣泡能將雜質(zhì)從晶體外表面趕走，減少雜質(zhì)進(jìn)入晶體造成各向生長(zhǎng)異性，晶體析出雜質(zhì)分子隨之減少，因此純度有所提升[26]，其綜合效益總體趨勢(shì)有所提高，50℃條件下綜合效益最高。

通過(guò)超聲輔助工藝的優(yōu)化，相較于傳統(tǒng)的種子結(jié)晶方法，超聲輔助結(jié)晶能夠降低誘導(dǎo)時(shí)間、過(guò)飽和濃度和亞穩(wěn)態(tài)區(qū)域?qū)挾龋行У卮龠M(jìn)混合控制結(jié)晶過(guò)程[27-28]。

綜上所述。超聲結(jié)晶的最佳實(shí)驗(yàn)條件為超聲功率400W、超聲時(shí)間40min、超聲溫度50℃，此時(shí)核黃素的收率可達(dá)到95%，純度超過(guò)96%。

2.3 核黃素超聲結(jié)晶后的表征分析

2.3.1 在光學(xué)顯微鏡下觀察超聲對(duì)核黃素結(jié)構(gòu)的影響

未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后的核黃素光學(xué)顯微圖（40倍）如圖5所示。

圖5 未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的光學(xué)顯微圖（40倍）

從圖5可以很明顯地看出，未經(jīng)過(guò)超聲得到的核黃素其形狀呈針狀，且有集聚情況。而經(jīng)過(guò)超聲處理后的核黃素形狀發(fā)生了較大改變，晶習(xí)變短，且比較均勻。這是由于超聲作用的引入，由于超聲波的輻射、微射流以及局部高溫高壓提升了溶質(zhì)分子混合的速率，降低了局部成核的數(shù)量，影響了晶體集聚的情況，解決了傳統(tǒng)種子結(jié)晶方法工業(yè)放大過(guò)程中結(jié)晶后晶體集聚的問題[29-30]。為了進(jìn)一步明確核黃素的晶體形狀，通過(guò)電子顯微鏡確認(rèn)。

2.3.2 在電子顯微鏡下觀察超聲對(duì)核黃素結(jié)構(gòu)的影響

未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的透射電鏡圖如圖6所示。

圖6 未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的電鏡透射圖

通過(guò)透射電鏡觀察到，經(jīng)過(guò)超聲后的晶型發(fā)生了明顯的變化，由原來(lái)的針狀晶型轉(zhuǎn)變?yōu)榻凭匦危移鋬?nèi)徑變小，長(zhǎng)度變短，長(zhǎng)寬比變小，且相對(duì)均勻。超聲作用下，由于超聲的空化作用，溶質(zhì)分子因其獲得了充分的速度及能量，溫度和濃度梯度減小，分子間的碰撞及相互加強(qiáng)，增加了穿過(guò)晶體表面靜止液層的可能性，其更易于進(jìn)入晶格，整齊排列，顯著地增加了溶液傳質(zhì)速率和傳質(zhì)推動(dòng)力[31]。

2.3.3 核黃素的XRD分析

核黃素的XRD 譜圖如圖7 所示。從圖7 可見，經(jīng)過(guò)超聲作用后，隨著超聲時(shí)間的加長(zhǎng)其峰強(qiáng)度有所增強(qiáng)。未超聲核黃素的結(jié)晶度是79.56%，通過(guò)最優(yōu)條件的超聲處理后，結(jié)晶度提升至84.21%，結(jié)果表明，在超聲作用下其結(jié)晶度有所改善。超聲波引入到溶液結(jié)晶過(guò)程中，利用超聲波的空化效應(yīng)，能使過(guò)飽和溶液的成核誘導(dǎo)期縮短，大大減少結(jié)晶時(shí)間，當(dāng)超聲波頻率增加時(shí)，晶體成核速度也會(huì)加快，成核誘導(dǎo)期變短。超聲結(jié)晶能夠簡(jiǎn)單有效地控制晶體成核數(shù)目及成核速度，形成的晶體晶形好、粒度分布均勻、晶體結(jié)構(gòu)也完整。優(yōu)化的超聲輔助工藝條件可以有效地控制晶體大小、純度、收率、結(jié)晶度和晶習(xí)[32]。

圖7 超聲功率為400W、不同超聲時(shí)間下核黃素結(jié)晶的XRD譜圖

3 結(jié)論

本文比較研究了溶劑析出法、溶劑析出結(jié)合酸溶法、控制結(jié)晶法、酸溶法和堿溶法等5種傳統(tǒng)的結(jié)晶純化方法的效果，其中酸溶法在收率和純度指標(biāo)上綜合效益最佳。在此基礎(chǔ)上添加超聲輔助處理，其最佳的實(shí)驗(yàn)條件為超聲功率為400W、超聲時(shí)間為40min、超聲溫度為50℃，核黃素的收率可達(dá)到95%，純度超過(guò)96%。超聲輔助酸溶結(jié)晶進(jìn)一步提高了核黃素的結(jié)晶度，易于成核，晶習(xí)更短，近似于矩形，晶體穩(wěn)定，分散性能更好，易于壓片成型，改善了應(yīng)用加工和工業(yè)放大特性。