張沛靈 慈政 賈立濤 劉豫 曹誼林 周廣東

軟骨缺損是臨床常見的疾病之一。由于缺乏血管與神經(jīng)，軟骨組織一旦受損便很難進(jìn)行自我修復(fù)［1-2］。目前的治療手段主要包括軟骨成形術(shù)、自體軟骨細(xì)胞移植、自體軟骨組織移植等，但均有其局限性［3］。組織工程技術(shù)為臨床軟骨修復(fù)提供了新的途徑和更廣闊的應(yīng)用前景［4-5］。組織工程研究主要包括三個(gè)方面：種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子。其中，數(shù)量充足的種子細(xì)胞是組織再生的物質(zhì)基礎(chǔ)，支架材料可以提供適宜的生理微環(huán)境，對(duì)體外構(gòu)建軟骨具有關(guān)鍵作用。

近年來，來源于各種組織和器官的脫細(xì)胞基質(zhì)支架越來越受到重視，被用于各種類型受損組織和器官的修復(fù)與再生［6-8］。軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（Acellular cartilage matrix，ACM）具有天然的促軟骨形成微環(huán)境，是最理想的軟骨組織工程支架材料。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）具有軟骨定向分化潛能，是一種理想的種子細(xì)胞來源。

本研究將脫細(xì)胞處理后的軟骨組織粉末以不同比例與明膠（Gelatin，GT）溶液混合并交聯(lián)，制成多孔仿生三維支架。接種山羊BMSCs 后體外短期誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞在支架上的黏附、分布與基質(zhì)分泌情況，并評(píng)估BMSCs 的成軟骨分化能力，為ACM 支架復(fù)合BMSCs 體外再生軟骨的研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑、儀器與動(dòng)物

DNase、RNase、抑肽酶、Tris-HCl、Triton X-100、明膠、EDC、NHS（Sigma，美國(guó)）；低糖DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清、PBS（Hyclone，美國(guó)）；DNA 定量試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）；DAPI（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

熒光顯微鏡（Leica，德國(guó)）；掃描電鏡（Philips XL-30，荷蘭）；力學(xué)分析儀（Instron，美國(guó)）；真空冷凍干燥機(jī)（上海億倍實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；全自動(dòng)冷凍研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

6 月齡山羊1 只（上海甲干生物科技有限公司）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

新鮮的牛肩胛軟骨在去除表面多余筋膜與結(jié)締組織后浸入液氮中5 min，冷凍研磨儀將軟骨組織研磨成細(xì)粉末，留取部分軟骨片用于驗(yàn)證脫細(xì)胞效率。隨后進(jìn)行脫細(xì)胞處理：0.5%（w／V）胰蛋白酶／PBS溶液在37 ℃中持續(xù)振蕩24 h，每4 h 更換新鮮的胰蛋白酶溶液。PBS 洗滌，核酸酶溶液（50 U／mL DNase、1 U／mL RNase 溶于10 mmol／L Tris-HCl，pH＝7.5）37 ℃振蕩4 h。10 mmol／L Tris-HCl 溶液（含10 U／mL抑肽酶）37 ℃振蕩20 h。1%（v／V）Triton X-100／PBS 37 ℃振蕩24 h。PBS 洗滌6 個(gè)循環(huán)，每次2 h。離心后將沉淀冷凍干燥制成ACM 粉末。

1.3 軟骨脫細(xì)胞效率的評(píng)估

1.3.1 組織學(xué)評(píng)估

將未脫細(xì)胞的天然軟骨與脫細(xì)胞處理后的軟骨片以4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 切片，行HE 染色。

1.3.2 細(xì)胞核熒光染色

將未脫細(xì)胞與脫細(xì)胞的軟骨片以4%多聚甲醛于室溫下固定，PBS 洗滌3 次。加入少量DAPI 染液，用量以覆蓋軟骨片表面為準(zhǔn)，室溫下染色5 min。吸除DAPI 染液，PBS 洗滌3 次，每次5 min。置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色情況。

1.3.3 DNA 定量檢測(cè)

使用DNA 定量試劑盒，按操作說明熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)未脫細(xì)胞與脫細(xì)胞處理后軟骨的DNA 含量。

1.4 不同比例ACM／GT 支架的制備

GT 用去離子水在37 ℃中振蕩溶解，配成0.8%的GT 溶液，并按一定比例加入ACM 粉末（表1），混勻后冷凍干燥處理，EDC-NHS 交聯(lián)，制成直徑8 mm、厚度2 mm 的圓柱狀支架，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.5 不同比例ACM／GT 支架的表征分析

1.5.1 孔徑大小評(píng)估

SEM 觀察并拍攝各組支架材料的表面微觀結(jié)構(gòu)，每組平行測(cè)量3 個(gè)樣本。Image-J 軟件分析圖片，選取不同視野的50 個(gè)孔隙測(cè)量各組孔徑。

1.5.2 孔隙率評(píng)估

一定體積的無水乙醇裝入一帶有刻度的試管，將支架材料浸入無水乙醇中，2 h 后記錄刻度變化為V1，取出支架材料后記錄刻度變化為V2，孔隙率＝（V2-V1）／V2×100%，每組平行測(cè)量3 個(gè)樣本。

1.5.3 生物力學(xué)評(píng)估

將支架材料置于力學(xué)分析儀上，沿垂直方向以0.5 mm／min 的速度向樣本施壓，直至樣本破碎。根據(jù)力-位移曲線計(jì)算得出各組的楊氏模量，每組平行測(cè)量3 個(gè)樣本。

1.5.4 降解速率評(píng)估

稱量并記錄各組樣本的初始重量M0，然后將樣本置于PBS 中37 ℃恒溫孵育，第1、7、14、28 天取出樣本用去離子水徹底浸泡洗滌，冷凍干燥后稱量并記錄m1。計(jì)算各組樣本在不同時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量損失，質(zhì)量損失率＝（m0-m1）×100%，每組平行測(cè)量3個(gè)樣本。

1.6 細(xì)胞的獲取與細(xì)胞支架復(fù)合物的制備

無菌條件下抽取山羊髂前上棘骨髓血15～20 mL，等體積比加入含10% 胎牛血清的低糖DMEM，1 500 r／min 離心5 min，吸除上層脂肪層。按每皿2 mL 骨髓血接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，第5 天細(xì)胞貼壁后全量換液，隨后擴(kuò)增并傳代，取第二代BMSCs 備用。

將第二代山羊BMSCs 制成6×107個(gè)／mL 的細(xì)胞懸液，均勻接種在消毒過的支架材料上，37 ℃、5%CO2環(huán)境下孵育4 h，后加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10 ng／mL 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，40 ng／mL 地塞米松，100 ng／ml 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 等；無血清）體外培養(yǎng)。第1、7、14 天SEM 觀察細(xì)胞在支架內(nèi)的黏附、分布與基質(zhì)分泌情況。

1.7 成軟骨分化能力評(píng)估

收集體外培養(yǎng)14 d 后的各組樣本，按試劑盒說明書提取樣本RNA，并行反轉(zhuǎn)錄PCR 分析。檢測(cè)成軟骨相關(guān)基因ACAN、COLⅡA1、Sox9，β-actin 設(shè)為內(nèi)參（表2）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 PCR 引物序列Table 2 PCR primer sequence

2 結(jié)果

2.1 軟骨脫細(xì)胞效率的評(píng)估

未脫細(xì)胞的天然軟骨HE 染色可見深藍(lán)色軟骨細(xì)胞核；ACM 則可見軟骨陷窩內(nèi)無細(xì)胞（圖1A、B）。未脫細(xì)胞天然軟骨在DAPI 染色后經(jīng)熒光激發(fā)可見散在發(fā)藍(lán)光的軟骨細(xì)胞核；ACM 在DAPI染色后熒光激發(fā)未見細(xì)胞核（圖1C、D）。DNA 定量數(shù)據(jù)顯示經(jīng)脫細(xì)胞處理后DNA 含量與天然軟骨相比下降了90%（圖1E）。這些結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞已被脫盡。

圖1 脫細(xì)胞效率的評(píng)估Fig.1 Evaluation of decellularization process

2.2 不同比例ACM／GT 支架的表征分析

各組ACM／GT 支架直徑約8 mm，厚度約2 mm，大體外觀無明顯差異。SEM 顯示各組孔徑分布較為均勻，孔徑大小有所差異（圖2）。

圖3 不同混合比例ACM／GT 支架的表征分析Fig.3 Characteristics of ACM／GT scaffolds with different proportions

G1A2 較單純明膠孔徑有所減小，隨著ACM 比例的增加，孔徑逐漸增大。G2A2 孔徑與單純明膠相近，分別為（249±21）μm 和（251±22）μm（圖3 A）。除G1A2 孔隙率有所上升外，其余組孔隙率無明顯差異，均在85%以上，適合軟骨生長(zhǎng)（圖3B）。同時(shí)，隨著ACM 比例增加，支架材料的力學(xué)強(qiáng)度逐漸減?。▓D3C）。各組支架在第1 天時(shí)質(zhì)量損失均在10%以下，之后隨著ACM 比例的增加，降解速率增快，其中G1A2 在第14 天時(shí)支架已經(jīng)破碎，無法維持固定形態(tài)（圖3D）。

各組不同比例ACM／GT 中，G2A2 的孔徑、孔隙率、力學(xué)強(qiáng)度、降解速率均適宜軟骨體外再生，因此選取G2A2 進(jìn)行體外構(gòu)建再生軟骨。

2.3 支架材料的生物相容性

SEM 結(jié)果顯示，第1 天時(shí)細(xì)胞呈球狀黏附在支架材料表面，同時(shí)伴隨有少量的基質(zhì)分泌；第7 天時(shí)細(xì)胞進(jìn)一步鋪展，均勻分布在支架表面，基質(zhì)分泌進(jìn)一步增加；第14 天時(shí)，細(xì)胞基質(zhì)已將材料表面完全覆蓋。同時(shí)，G2A2 組較單純明膠有更為豐富的基質(zhì)分泌（圖4）。

圖4 細(xì)胞-支架復(fù)合物的大體觀及掃描電鏡觀察Fig.4 Gross view and SEM observation of cell-scaffold constructs

2.4 ACM／GT 支架對(duì)BMSCs 成軟骨分化的影響

使用qRT-PCR 對(duì)BMSCs 成軟骨分化相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與單純明膠相比，G2A2 的ACAN、COLⅡA1、Sox9 的mRNA 表達(dá)水平均有顯著上調(diào)，顯示了ACM 的存在促進(jìn)了BMSCs 的成軟骨分化（圖5）。

圖5 成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 Expression of chondrogenesis related genes

3 討論

外傷、炎癥、衰老所造成的軟骨損傷一直是臨床上非常棘手的難題。為了有效地修復(fù)軟骨損傷，缺損的區(qū)域需要填充一定體積與力學(xué)強(qiáng)度的修復(fù)組織［9］。軟骨組織工程技術(shù)可以在體外構(gòu)建各方面與天然組織相似的再生組織，為臨床治療軟骨缺損提供了新的途徑［10］。種子細(xì)胞和支架材料是組織工程技術(shù)的重要組成部分，為良好的修復(fù)效果提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前用于軟骨組織工程的種子細(xì)胞來源主要是軟骨細(xì)胞和具有軟骨定向分化潛能的干細(xì)胞，如BMSCs 等。由于軟骨細(xì)胞自體來源有限，且取材較為困難，無法獲取足夠數(shù)量的活性細(xì)胞，臨床應(yīng)用受限［11-12］。BMSCs 獲取途徑方便，且細(xì)胞增殖速度快。以往研究已經(jīng)證實(shí)BMSCs 在關(guān)節(jié)軟骨微環(huán)境的調(diào)節(jié)下可以修復(fù)軟骨缺損［13］。因此，本研究選取山羊BMSCs 作為種子細(xì)胞來源。

支架材料也是組織工程另一個(gè)具有關(guān)鍵作用的組成部分。理想的支架材料需要滿足以下要求：①具有三維多孔結(jié)構(gòu)及合適的孔徑、孔隙率以供細(xì)胞生長(zhǎng)；②一定強(qiáng)度的力學(xué)支撐以維持再生組織的形態(tài)；③合適的降解速率，在保持再生組織三維形態(tài)的條件下減少進(jìn)入體內(nèi)后的炎癥反應(yīng)；④良好的生物相容性；⑤與天然組織相似的仿生微環(huán)境。常用于組織工程再生修復(fù)的支架材料主要包括人工合成材料和天然可降解材料。人工合成材料，如PGA、PLA、PLGA 等，其降解產(chǎn)物具有一定的細(xì)胞毒性，不利于細(xì)胞活性維持和組織的良好再生。天然可降解材料具有良好的生物相容性，有利于細(xì)胞的黏附與增殖［14］。近年來，組織工程領(lǐng)域出現(xiàn)了一種新的趨勢(shì)，即將脫細(xì)胞基質(zhì)作為組織再生的支架材料。各種類型的脫細(xì)胞基質(zhì)可以為細(xì)胞提供獨(dú)特的天然微環(huán)境，以幫助干細(xì)胞的分化和組織再生［15］。但由于軟骨組織較為致密，直接將大塊軟骨進(jìn)行脫細(xì)胞處理很難達(dá)到理想的脫細(xì)胞效果，而殘留的細(xì)胞成分會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，因此通常將軟骨粉碎至粉末狀以提升軟骨組織的脫細(xì)胞效率［16-17］。而單獨(dú)應(yīng)用ACM 粉末很難將其塑形為具有一定三維立體形狀的支架材料，因此本研究混合了一定比例的GT溶液以提升ACM 的交聯(lián)性能，經(jīng)冷凍干燥成功制備出了具有圓柱狀三維形態(tài)的ACM／GT 多孔仿生支架。結(jié)果顯示，不同混合比例的ACM／GT 支架在孔徑、孔隙率、力學(xué)強(qiáng)度、降解速率等方面均有所差異，因此選取各方面參數(shù)最適宜軟骨再生的G2A2 進(jìn)行體外構(gòu)建再生軟骨。有研究表明，脫細(xì)胞軟骨片復(fù)合自體BMSCs 可以有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損［18］。然而，粉碎后的ACM 粉末是否仍然保留BMSCs 的軟骨定向誘導(dǎo)作用猶未可知。

本研究將G2A2 支架與山羊BMSCs 復(fù)合，體外成軟骨誘導(dǎo)14 d。SEM 顯示細(xì)胞在支架上逐漸鋪展、增殖，基質(zhì)分泌逐漸增多，支架的生物相容性良好。qRT-PCR 顯示，G2A2 上調(diào)了BMSCs 成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)了BMSCs 的成軟骨分化。對(duì)于ACM 促進(jìn)軟骨形成的機(jī)制，目前知之甚少。所提出的假設(shè)主要有：①ACM 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響；②ACM中殘留的生長(zhǎng)因子；③ACM 的天然微觀結(jié)構(gòu)；④ACM中生化成分（糖胺聚糖和膠原）的影響［19］。

綜上所述，ACM 可以制成適宜軟骨再生的三維多孔仿生支架，且能有效誘導(dǎo)BMSCs 的成軟骨分化，是一種理想的軟骨組織工程支架材料，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。