雷曉旭 王春 趙曦

牙周膜干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周組織再生修復(fù)的重要種子細(xì)胞［1］。相關(guān)研究表明，牙周組織再生修復(fù)能力在慢性牙周炎的侵襲作用下可明顯降低。目前，修復(fù)牙周炎導(dǎo)致的牙周組織損傷的研究主要圍繞如何促進(jìn)牙槽骨再生［2］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）對(duì)干細(xì)胞成骨分化具有誘導(dǎo)作用，其較為突出的亞型主要是BMP2、BMP7 和BMP9。李靜等［3］的研究顯示，BMP2、BMP7 和BMP9 的表達(dá)可介導(dǎo)永生化成牙本質(zhì)細(xì)胞（Immortalized odontoblasts，iODs）成骨分化。與BMP7 比，BMP2 和BMP9 介導(dǎo)iOD 的成骨分化作用更強(qiáng)。進(jìn)一步的研究表明，BMPs 誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制與激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-actibated protein kinases，MAPKs）通路相關(guān)［4］，MAPKs 中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（Extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）在血管生成和細(xì)胞分化方面均具有一定的作用［5］。Tsioumpekou 等［6］研究證實(shí)，ERK5 影響基因表達(dá)的機(jī)制在于被激活的ERK5 可介導(dǎo)BMPs 的釋放和／或活化，即形成BMPs-ERK5 信號(hào)通路。在炎癥微環(huán)境作用下，原代人牙周膜干細(xì)胞（Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的骨分化能力降低，牙周組織再生修復(fù)能力降低，BMPs-ERK5信號(hào)通路是否參與這個(gè)病理過(guò)程，目前鮮有研究報(bào)道。本文旨在探討炎癥微環(huán)境作用下BMPs-ERK5信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs 成骨分化的影響，為牙槽骨再生的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

離體牙樣本源自因治療需要拔除的健康以及慢性牙周炎的病例樣本。于慢性牙周炎患者獲取炎癥牙周膜組織，于因正畸需要拔除健康牙的患者獲取正常牙周膜組織。采用Armitage 推薦的慢性牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①X 線片顯示牙槽骨吸收超過(guò)2／3；②沒(méi)有吸煙史；③近6 個(gè)月沒(méi)有服用特殊藥物；④所有組織樣本均來(lái)源于本院口腔科；⑤所有患者已簽署知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

腺病毒載體Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9、綠色熒光蛋白腺病毒載體（Ad-green fluorescent protein，Ad-GFP）均購(gòu)自美國(guó)芝加哥大學(xué)分子腫瘤研究室；p-ERK5 抗體（CST 公司，美國(guó)）；BMPs-ERK5 信號(hào)通路特異性抑制劑BIXO2189（Selleck 公司，美國(guó)）；Ⅰ型膠原酶、維生素C、β-磷酸甘油（Sigma 公司，美國(guó)）；DMEM／F12 培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）；角蛋白抗體、波形蛋白抗體和熒光兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)）；堿性磷酸酶（Alkaline phosphorylase，ALP）活性檢測(cè)試劑盒、ALP 顯色試劑盒、Western blot 試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；茜素紅染液（Solarbio 公司，美國(guó)）；qRT-PCR 試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.2 分離、培養(yǎng)hPDLSCs

準(zhǔn)備已預(yù)冷并含有雙抗的DMEM／F12 培養(yǎng)基，將上述牙齒拔除后立即放入其中，確認(rèn)牙周膜組織附著完整后立即轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中，使用2×的生理鹽水對(duì)牙根進(jìn)行反復(fù)沖洗，手術(shù)刀刮取根中1／3 牙周膜組織置于1.5 mL 的離心管中，并加入1 mL Ⅰ型膠原酶，37 ℃水浴30 min，每隔5 min 振蕩1 次。加入1 mL 含10%FBS 的DMEM／F12 培養(yǎng)液，1 200 r／min 離心，棄上清，處理后的樣本移入鋪有一層血清的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入3 mL DMEM／F12完全培養(yǎng)液并倒置存放，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，第2 天翻轉(zhuǎn)正置繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞爬出組織塊，72 h 更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.3 應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色鑒定hPDLSCs

于24 孔板內(nèi)接種第3 代hPDLSCs，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)以PBS 清洗，5 min／次，清洗3 次，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min（0.1% TRriton-100），1%BSA 封閉5 h，滴加抗波形蛋白，4 ℃孵育12 h，PBS 清洗后加入兔二抗，37 ℃孵育60 min，使用DIPA 染核5 min，純凈水終止，抗粹滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 細(xì)胞克隆形成

取第3 代hPDLSCs 消化，將400 個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 個(gè)克隆形成單位以50 個(gè)細(xì)胞為準(zhǔn)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，10～14 d 后取出培養(yǎng)皿，4%多聚甲醛固定30 min，漂洗3 次，染色30 min，PBS 漂洗終止，倒置顯微鏡下拍照并觀察。

1.5 ALP 染色及ALP 活性檢測(cè)

將Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7 和Ad-BMP9蛋白分別轉(zhuǎn)染hPDLSCs：取第四代hPDLSCs 接種于24 孔板。將Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 分別加入貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞中，設(shè)為Ad-GFP組、Ad-BMP2 組、Ad-BMP7 組、Ad-BMP9 組。熒光轉(zhuǎn)染率約為50%，8 h 后換液并培養(yǎng)5～7 d，PBS沖洗。

ALP 染色：采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS染色，將250 μL BCIP／NBT 染色工作液加入到孔板中，室溫孵育30 min，ddH2O 洗滌、吸棄染液2 次并終止反應(yīng)，倒置顯微鏡觀察各組ALP 染色情況。ALP 活性檢測(cè)：每孔分別加入200 μL 0.2% Triton X-100裂解細(xì)胞，于1.5 mL EP 管中置入刮取裂解物，1 200 r／min 離心3 min，取上清液，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與作用時(shí)間計(jì)算樣本ALP活性值，檢測(cè)ALP 活性。每組設(shè)6 復(fù)孔，3 復(fù)孔用以ALP 染色，3 復(fù)孔用以檢測(cè)ALP 活性。

將活性最高的BMPx 作為研究對(duì)象，按以上方法轉(zhuǎn)染第五代hPDLSCs，并做不同處理。設(shè)置5 組：空白組、Ad-GFP 組、Ad-BMPx 組、Ad-BMPx ＋2.5 μmol／L BIX02189 組及Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 組，每組設(shè)3 復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，Ad-GFP組加入適量Ad-GFP，Ad-BMPx 組、Ad-BMPx ＋2.5 μmol／L BIX02189 組及Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 組加入適量Ad-BMP9，空白組加適量PBS，8 h 后換液，Ad-BMPx＋2.5 μmol／L BIX02189組及Ad-BMPx＋10 μmol／L BIX02189 組分別加入2.5 μmol／L 和10 μmol／L BIX02189。7 d 后行ALP染色，鏡下觀察各組ALP 染色情況。

1.6 茜素紅染色

分為Ad-GFP 組、Ad-BMP2 組、Ad-BMP7 組、Ad-BMP9 組與空白組、Ad-GFP 組、Ad-BMPx 組、Ad-BMPx ＋2.5 μmol／L BIX02189 組、Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 組。當(dāng)熒光感染率達(dá)到30%后8 h 換液（50 mg／L 維生素C＋10 mmol／L β-磷酸甘油），21 d 后PBS 沖洗，采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗，將0.2%茜素紅染色液200 μL 加入到每個(gè)孔板中，室溫孵育60 min，ddH2O 洗滌3 次并使顯色反應(yīng)終止，倒置顯微鏡觀察各組成骨晚期分化指標(biāo)鈣鹽沉積情況。

1.7 qRT-PCR

分為Ad-GFP 組、Ad-BMP2 組、Ad-BMP7 組、Ad-BMP9 組。培養(yǎng)7 d 后使用PBS 沖洗，使用微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)分離的細(xì)胞總RNA 純度和濃度。遵循試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)，使用Bio-rad CFX實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因OCN、OPN 的mRNA 表達(dá)，成骨分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)內(nèi)參β-actin 與Bio-rad CFX Manager 軟件進(jìn)行參照分析（表1）。

分為空白組、Ad -GFP 組、Ad -BMPx 組、Ad-BMPx＋2.5 μmol／L BIX02189 組、Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 組。采用qRT-PCR 檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因OCN、OPN、OSX、RUNX2 的mRNA 表達(dá)。（表1）

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 Western blot 檢測(cè)

分為空白組、Ad -GFP 組、Ad -BMPx 組、Ad-BMPx＋2.5 μmol／L BIX02189 組、Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 組。培養(yǎng)24 h 后提取總蛋白并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。電泳分離、封閉、轉(zhuǎn)膜，加入p-ERK5 一抗（1 ∶1 000）及β-actin 一抗（1 ∶5 000），4 ℃孵育12 h，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1 ∶5 000），應(yīng)用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)EPidata 3.1 軟件雙人錄入收集的研究資料，SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定和培養(yǎng)hPDLSCs

光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)牙周膜組織應(yīng)用組織塊酶分解后呈長(zhǎng)梭狀的纖維細(xì)胞，漩渦狀增殖為傳代后表現(xiàn)。細(xì)胞熒光染色法顯示波形蛋白呈陽(yáng)性，角蛋白表達(dá)呈陰性，說(shuō)明培養(yǎng)的hPDLSCs 來(lái)源于中胚層間充質(zhì)細(xì)胞，而非來(lái)源于上皮細(xì)胞。鏡下顯示生長(zhǎng)2 周的hPDLSCs 形成克隆，密度較大，呈圓形（圖1）。

圖1 鑒定和培養(yǎng)hPDLSCsFig.1 Identification and culture of hPDLSCs

2.2 BMPs 促進(jìn)hPDLSCs 細(xì)胞成骨分化

ALP 染色和活性檢測(cè)顯示，與Ad-GFP 組比，Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 三組的ALP 表達(dá)顯著增加（P＜0.05），Ad-BMP9 組早期成骨ALP 的表達(dá)最高，其次為Ad-BMP2 和Ad-BMP7（圖2A、2B）。

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與Ad-GFP 組比，Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 三組的細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因OCN 和OPN mRNA 均顯著增加（P＜0.05），Ad-BMP9 組的OCN 和OPN mRNA 最高，其次為Ad-BMP2 和Ad-BMP7（圖2C）。

茜素紅染色結(jié)果顯示，與Ad-GFP 組比，Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 三組的鈣鹽結(jié)節(jié)沉積顯著增加，Ad-BMP9 組晚期成骨誘導(dǎo)最強(qiáng)，其次為Ad-BMP2 和Ad-BMP7（圖2D）。

以上結(jié)果表明，相對(duì)于Ad-BMP2、Ad-BMP7，Ad-BMP9 具有較強(qiáng)的促hPDLSCs 成骨分化作用。因此，將Ad-BMP9 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，研究BMPs-ERK5 信號(hào)通路與hPDLSCs 細(xì)胞成骨分化的關(guān)系。

2.3 ERK5 信號(hào)通路參與BMP9 誘導(dǎo)hPDLSCs 成骨分化

Western-blot 檢測(cè)顯示（圖3），與空白組及Ad-GFP 組比，Ad-BMP9 組的ERK5 磷酸化（p-ERK5）表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與Ad-BMP9 組比，Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 組和Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 組的p-ERK5 表達(dá)顯著 降 低（P＜0.05）；與Ad -BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 組比，Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 組的p-ERK5 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

ALP 染色和活性檢測(cè)顯示（圖4A、4B），與空白組及Ad-GFP 組比，Ad-BMP9 組的ALP 表達(dá)顯著增加（P＜0.05），與Ad-BMP9 組比，Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 組 和Ad-BMP9 ＋10 μmol／L BIX02189 組的ALP 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），與Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 組 比，Ad-BMP9 ＋10 μmol／L BIX02189 組的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

qRT-PCR 檢測(cè)顯示（圖4C），與空白組及Ad-GFP 組比，Ad-BMP9 組的成骨分化相關(guān)基因OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05），與Ad -BMP9 組 比，Ad -BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 組和Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 組的OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），與Ad-BMP9＋2.5 μmol／L BIX02189 組比，Ad-BMP9 ＋10 μmol／L BIX02189 組的OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。茜素紅染色結(jié)果顯示（圖4D），與空白組及Ad-GFP組比，Ad-BMP9 組的鈣鹽結(jié)節(jié)沉積顯著增加，與Ad -BMP9 組 比，Ad -BMP9 ＋2.5 μmol／LBIX02189 組和Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 組的鈣鹽結(jié)節(jié)顯著降低，與Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 組比，Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 組的鈣鹽結(jié)節(jié)顯著降低。

圖2 BMPs 促進(jìn)hPDLSCs 細(xì)胞成骨分化Fig.2 BMPs promoted osteogenic differentiation of HPDLSCs cells

圖3 Western-blot 檢測(cè)各組細(xì)胞p-ERK5 蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of p-ERK5 protein in each group detected by Western-blot

以上結(jié)果表明，ERK5 信號(hào)通路未被抑制時(shí)，Ad-BMP9具有較強(qiáng)的促hPDLSCs 成骨分化作用，當(dāng)ERK5 信號(hào)通路被特異性抑制時(shí)，Ad-BMP9 的促hPDLSCs 成骨分化作用也被抑制，提示ERK5 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)BMP9 誘導(dǎo)的hPDLSCs 細(xì)胞的成骨分化作用。

圖4 ERK5 信號(hào)通路參與BMP9 誘導(dǎo)的hPDLSCs 成骨分化Fig.4 ERK5 signaling pathway involved in regulating BMP9-induced osteogenic differentiation of hPDLSCs

3 討論

包括牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的牙周支持組織完全再生是治療牙周病的理想結(jié)果［8］。作為治療牙周疾病的新方法，組織工程技術(shù)具有巨大潛力，而其中發(fā)揮主要作用的就是種子細(xì)胞［9］。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)維持牙周生理性動(dòng)態(tài)平衡的牙槽骨出現(xiàn)失衡時(shí)，就會(huì)伴隨著病理性過(guò)程的發(fā)生，間充質(zhì)干細(xì)胞則是參與維持上述動(dòng)態(tài)平衡的細(xì)胞［10］。相關(guān)研究表明，干細(xì)胞的各項(xiàng)功能受到嚴(yán)密的分子調(diào)控［11］。從干細(xì)胞到成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子信號(hào)可參與其中，如目前已被證實(shí)的GFF、Wnt、BMP 和PI3K／Akt 等，這些信號(hào)通路通過(guò)影響成骨細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子參與其中［12］。BMPs 信號(hào)通路通過(guò)Smad 途徑調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，MAPKs 信號(hào)途徑則是刺激信號(hào)從細(xì)胞表面到核內(nèi)的重要傳遞者［13］。ERK5，屬于絲氨酸蛋白激酶，磷酸化激活后由胞漿釋放到胞核，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子MEF 結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞抗凋亡、分化和血管生成等的生物學(xué)行為［14］。

相關(guān)研究表明，MERK1／ERK1 和MERK2／ERK2分別對(duì)骨生長(zhǎng)起到正向和負(fù)向調(diào)節(jié)的作用，但目前BMPs-ERK5 信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs 成骨分化的影響尚不清楚［15］。本研究通過(guò)組織塊酶消化法分離獲得hPDLSCs，通過(guò)腺病毒載體介導(dǎo)及轉(zhuǎn)染的方式，使hPDLSCs 高表達(dá)BMP9、BMP2 及BMP7 蛋白，對(duì)比3種BMPs 對(duì)hPDLSCs 成骨分化的作用效果。進(jìn)一步，將對(duì)hPDLSCs 成骨分化影響最強(qiáng)的BMPs 再次轉(zhuǎn)染hPDLSCs，檢測(cè)其p-ERK5 水平，并加入BMPs-ERK5信號(hào)通路特異性抑制劑BIXO2189 預(yù)處理后，考察對(duì)hPDLSCs 成骨分化的影響。早期成骨分化、成骨分化相關(guān)基因及晚期成骨分化指標(biāo)均顯示，Ad-BMP2、Ad-BMP7 及Ad-BMP9具有較強(qiáng)的hPDLSCs 成骨分化作用，Ad-BMP9促進(jìn)hPDLSCs 成骨分化的作用最強(qiáng)。進(jìn)一步，在ERK5 信號(hào)通路特異性抑制劑BIX02189干擾下，ERK5 表達(dá)降低，Ad-BMP9 的hPDLSCs 成骨分化作用也被抑制，且呈BIX02189 劑量依賴性的趨勢(shì)，提示ERK5 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)BMP9 誘導(dǎo)的hPDLSCs 細(xì)胞的成骨分化作用，類似文獻(xiàn)也顯示，BMP9 的成骨分化誘導(dǎo)過(guò)程由ERK5 信號(hào)通路參與介導(dǎo)［16-17］。

綜上所述，在慢性炎癥微環(huán)境下，BMP9 具有可誘導(dǎo)hPDLSCs 成骨分化的作用，ERK5 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)BMP9 誘導(dǎo)的hPDLSCs 的成骨分化作用。